原代細(xì)胞切割，取材儀 生物工程

功能特點

原代細(xì)胞切割，取材儀 

適用于切割臍帶、胎盤、皮膚等軟性組織；

切割均勻，易于爬出和培養(yǎng)；

大幅減少人工剪切時間和降低工作勞累；

即插即用，采用拋棄型耗材，避免重復(fù)污染；

電動型，適合用于在生物安全柜里無菌操作

可個性化定制

•上海潤予生物醫(yī)療科技有限公司坐落于浦東自由貿(mào)易試驗區(qū)張江高科技園區(qū)，是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、實驗室自動化定制、銷售、服務(wù)及生物樣本庫解決方案為一體的技術(shù)企業(yè)。公司定位于為自動化領(lǐng)域提供具有*自主知識產(chǎn)權(quán)的系列產(chǎn)品和系統(tǒng)集成服務(wù)，針對日益上升的科研實驗室、檢驗科等領(lǐng)域自動化的需求，公司提供實驗室自動化整合解決方案，為用戶提高工作效率、降低成本，滿足客戶的各種需求 。

由于細(xì)胞異質(zhì)性的存在，單細(xì)胞層面的分析就變得十分重要。目前對于單細(xì)胞分析的方法主要還是通過化學(xué)、生物學(xué)的方法進行裂解后，提取內(nèi)容物進行分析，然而這種方法往往會對樣本造成一些損傷。直接提取活細(xì)胞具有諸多優(yōu)點，但是操作苦難。如今一種全新使用FluidFM科技的技術(shù)新報道有望提供一種活細(xì)胞提取新型的簡易方法。

1.為什么要進行活體單細(xì)胞提取

隨著技術(shù)的發(fā)展，對于細(xì)胞的研究開始向單細(xì)胞領(lǐng)域的分析靠攏。隨著細(xì)胞異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)以來，人們開始更多地認(rèn)識到即使基因型*相同，但由于基因表達的不同，也會導(dǎo)致細(xì)胞的表型出現(xiàn)差異，從而使得每個細(xì)胞的功能、組成等各方面也不*相同。而這種差異是在生物界廣泛存在的，即使同源細(xì)胞群中也是存在的。因此對于單細(xì)胞層面的分子分析，成為了揭示病理特征，細(xì)胞應(yīng)激等方面的重要手段。

在目前的單細(xì)胞分析手段中也面臨著諸多挑戰(zhàn)。目前主要的方法是使用流式細(xì)胞儀或者微流控芯片對細(xì)胞進行分選并隔離單細(xì)胞，然后通過裂解的方式對細(xì)胞進行分析。這種高通量分選的方式雖然快速，但是本身需要將細(xì)胞從原始的培養(yǎng)環(huán)境中取出，這樣始終會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部一些生物信息的丟失或損傷。而且由于細(xì)胞破壞方式使用的是化學(xué)或者生物手段裂解，所使用的裂解液也會對細(xì)胞之中的一些組分產(chǎn)生破壞。因此單細(xì)胞分析始終面臨著重大的挑戰(zhàn)。

因此，學(xué)者開始嘗試從活細(xì)胞中直接提取其成分。目前已經(jīng)有諸多不同的活細(xì)胞提取技術(shù)得到了建立，并且通過這類的方法所提取分析內(nèi)容的方法所獲得的結(jié)果往往要好于裂解的方式。因此活細(xì)胞提取技術(shù)是一種更加無損的獲得細(xì)胞內(nèi)組分的方式。

2.使用FluidFM設(shè)備提取細(xì)胞并不會影響細(xì)胞活力

在本文中，作者對首先建立了一種使用FluidFM提取細(xì)胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM能夠?qū)?xì)胞提取的大量。在實驗中他們發(fā)現(xiàn)使用FluidFM抽取4 pL的細(xì)胞質(zhì)并觀測，發(fā)現(xiàn)82%的細(xì)胞依然存活，如圖1B所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無細(xì)胞能夠存活。而對細(xì)胞核而言抽取0.6 pL后，有86%的細(xì)胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL或以上的體積提取則不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如圖1B所示。隨后他們對提取后細(xì)胞的存活狀況進行了考察。而后他們繼續(xù)對提取過的細(xì)胞進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的功能并沒有受到影響。細(xì)胞能夠在提取后約30小時后正常分裂，如圖1E所示。因此作者認(rèn)為使用FluidFM提取的大量為細(xì)胞核0.6 pL和細(xì)胞質(zhì)4pL。

3.使用FluidFM單細(xì)胞提取物的三種應(yīng)用

3.1透射電鏡負(fù)染色觀測

對于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的觀察，往往對于揭示細(xì)胞病變有著重要的意義。然而細(xì)胞裂解的傳統(tǒng)手段往往會產(chǎn)生大量的碎片，因此對細(xì)胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報道中，作者通過使用FluidFM設(shè)備提取細(xì)胞內(nèi)容物，在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到透射電鏡的銅網(wǎng)上，然后進行負(fù)染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統(tǒng)裂解方法得到單細(xì)胞溶液同時鋪設(shè)在銅網(wǎng)上進行對比。通過觀察他們發(fā)現(xiàn)，使用FluidFM技術(shù)得到的細(xì)胞提取物能夠觀察到大泡狀的結(jié)構(gòu)、小球狀的結(jié)構(gòu)和長絲類的結(jié)構(gòu)，如圖2C所示。而相比之下細(xì)胞裂解法得到的結(jié)果卻不盡人意，如圖2D所示。

3.2酶活力的檢測

酶活力的檢測對于探尋細(xì)胞異質(zhì)性有著十分重要的意義。因此作者也對FluidFM提取的細(xì)胞提取物進行了對比。首先作者通過β-半乳糖苷酶實驗來測定提取蛋白的完整性。通過測定酶解底物產(chǎn)生的熒光素的熒光強度，他們成功觀察到熒光強度隨時間而增加，說明提取物中的蛋白沒有被破壞，如圖3C、D所示。隨后作者又對不同細(xì)胞進行了不同酶活力的檢驗，結(jié)果顯示無論是LacZ轉(zhuǎn)基因HeLa細(xì)胞上還是在測定HeLa細(xì)胞的Caspase3酶上均取得了成功，如圖3 E、F所示。

4.3單細(xì)胞級轉(zhuǎn)錄檢測

單細(xì)胞層面的基因表達通常需要反轉(zhuǎn)錄或者PCR擴增，之后使用qPCR測定。而在此之前往往需要將細(xì)胞裂解，而作者他們采用了與傳統(tǒng)方法不同的策略。他們首先創(chuàng)建了使用FluidFM直接從活細(xì)胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR管合成cDNA并進行qPCR檢測，如圖4A所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL水中，然后再轉(zhuǎn)移到PCR管中，進行合成和檢測如圖6B所示。他們檢測了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA的表達量。在21個樣本中有90%的樣本成功檢測到至少1中基因的表達，其中2/3的樣本可以同時檢測到三種基因的表達。而對細(xì)胞核的檢測中，也能夠檢測到至少一種基因的表達，如圖4C所示。在對比同一細(xì)胞同時提取細(xì)胞質(zhì)（1.7 pL）和細(xì)胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達時，可以發(fā)現(xiàn)兩者基本相同，如圖4D所示。

總結(jié)

隨著生物研究越發(fā)趨于微觀化，對于分析單個細(xì)胞的需求變得越來越大。但是由于單個細(xì)胞體積小，所能夠提取出的物質(zhì)相比以前細(xì)胞群落分析來說，難度顯著提高。這不僅對檢測儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時對樣本本身的質(zhì)量也提出了更高的指標(biāo)。本篇中使用FluidFM提取活細(xì)胞所取得的樣本質(zhì)量相比于傳統(tǒng)裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結(jié)果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細(xì)胞的情況下完成提取，這使得對于對單個細(xì)胞代謝測定的追蹤成為了可能。