產(chǎn)品編號(hào)：DG1001-2

包裝規(guī)格：4 x 96孔板

試劑盒組成

保存方法

本試劑盒應(yīng)在室溫(15~25℃)干燥條件下保存。

產(chǎn)品介紹

本試劑盒可從樣品中快速提取總 RNA?？蓮呐囵B(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物組織中提取總RNA。

本試劑盒提供了一套緩沖液系統(tǒng)，無需BF/氯仿抽提，并提供吸附柱。提取的RNA可用于mRNA分離、探針制備、RT-PCR、Northern blot、引物延伸、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)和體外翻譯等。操作簡單快速，總RNA的提取不超過1小時(shí)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1. 小于1小時(shí)內(nèi)提取出總RNA。

2. 提取的總RNA質(zhì)量高，無基因組DNA污染。

3. 得率高，重復(fù)性好。

4. 無需BF/氯仿抽提或乙醇沉淀。

應(yīng)用

從動(dòng)物組織中可純化出至多20 μg 的總RNA。純化的RNA可直接用于任何后續(xù)實(shí)驗(yàn)，包括：

ü   RT-PCR

ü   實(shí)時(shí)熒光定量PCR

ü   差異顯示

ü   cDNA合成

ü   Northern, dot 和slot blot 分析

ü   引物延伸

ü   Poly A + RNA 篩選

ü   RNase/S1 核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)

ü   微陣列

用戶需自備的材料

ü   離心速度至少達(dá)到~5600×g的離心機(jī)（2 x 96水平轉(zhuǎn)子）

ü   RNase-Free 的多通道移液槍和槍頭

ü   RNase-Free 的乙醇(96%以上)

ü   RNase-Free 的乙醇(70%)

ü   14.5M β-mercaptoethanol (β-ME,可選)

ü   DNase I(可選)

試劑準(zhǔn)備

每次使用前檢查 CLB Solution 是否出現(xiàn)沉淀。如出現(xiàn)沉淀，將溶液于56℃溫浴使沉淀溶解，降至室溫后再使用。

提供的 WBII Solution 為濃縮液。Shou次使用時(shí)，50 ml WBII Solution中應(yīng)加入200 ml 乙醇，以配制成工作液。

注意：產(chǎn)品僅用于基礎(chǔ)科學(xué)研究，不可用于人類或動(dòng)物！

標(biāo)準(zhǔn)操作步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

培養(yǎng)的細(xì)胞

1a. 懸浮細(xì)胞：取不超過5 x 10⁵的細(xì)胞，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔，~300 x g離心，離心后移除細(xì)胞培養(yǎng)基。

1b. 單層細(xì)胞：移除細(xì)胞培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)基的去除將在隨后的步驟中會(huì)稀釋CLB Solution，抑制裂解和RNA與純化板膜的結(jié)合。這將導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

2. 加入150 μl CLB Solution到細(xì)胞培養(yǎng)孔中。用多通道移液槍反復(fù)吹打5-6次，使細(xì)胞充分裂解。

吹打過程中應(yīng)避免產(chǎn)生過多氣泡。

3. 每孔加入150 μl RNase-Free 的乙醇(70%)，用多通道移液槍吹打3次，混勻。

4. 將96孔總RNA純化板置于96孔深孔板上。

5. 將裂解液全部轉(zhuǎn)移至96孔RNA純化板中，覆蓋透氣膜。

板密封后離心，防止交叉污染。

6. 6000 rpm（~5600 x g）室溫離心4min，離心后倒出下層深孔板中的濾液。

7. DNaseI處理基因組DNA（可選）。

通常不需要DNase I消化，因?yàn)?/span>RNA純化板中的二氧化硅膜技術(shù)在沒有DNase處理的情況下有效地去除了大部分DNA。然而對(duì)于對(duì)非常少量的DNA敏感的某些RNA應(yīng)用來說，進(jìn)一步的DNA去除可能是可取的。

8. 取下透氣膜，向96孔總RNA純化板的每個(gè)孔中加入600 μl WBI Solution，覆蓋透氣膜。

9. 6000 rpm（~5600 x g）室溫離心4min，離心后倒出下層深孔板中的濾液。

10. 取下透氣膜，向96孔總RNA純化板的每個(gè)孔中加入600 μl WBII Solution，覆蓋透氣膜。

11. 6000 rpm（~5600 x g）室溫離心4min，離心后倒出下層深孔板中的濾液。

12. 重復(fù)一次步驟10~11。

13. 將96孔總RNA純化板重新放回深孔板中，6000 rpm（~5600 x g）室溫離心5min。

14. 小心取出96孔總RNA純化板，放入96孔總RNA收集板中，取下透氣膜，室溫涼置5min，使乙醇揮發(fā)。

15. 向96孔總RNA純化板中加入30~50 μl H2O RNase-Free，覆蓋新的透氣膜，室溫靜置2min。

16. 6000 rpm（~5600 x g）室溫離心4min。

17. 重復(fù)一次步驟15~16。

為了回收RNA，需要重復(fù)洗脫步驟，但RNA濃度液會(huì)相應(yīng)降低，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的洗脫體積。洗脫體積將比添加到膜中的RNase游離水的體積小15μl，對(duì)應(yīng)于膜的死體積。

18. 取下96孔總RNA純化板，使用密封膜覆蓋保存。

離心管中的溶液為RNA樣品，可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或保存于-70°C。

注意事項(xiàng)

樣品用量

常見問題指南

1. RNA 中有DNA污染

A． 減少原始材料用量。

B． 對(duì)于一些DNA含量非常高的組織（比如胸腺），請(qǐng)嘗試使用更少的樣品。

2. RNA 得率低

A． 我們推薦使用新鮮樣品。

B． 將細(xì)胞裂解，保證RNA充分釋放。

C． 使用適量樣品。RNA得率取決于樣品的類型、大小、年齡和保存方法。請(qǐng)參考說明書的推薦用量。

D． 檢查 WBII Solution 是否已加入無水乙醇。

E.  請(qǐng)嚴(yán)格參照說明書對(duì)樣品進(jìn)行洗脫。

3. RNA 降解

A． 在 RNase-Free 的環(huán)境中操作。

B． 所有操作步驟中都佩戴手套。經(jīng)常更換手套。

C． 推薦使用RNase-Free的移液器及吸頭。

D． 細(xì)胞裂解過程置冰上操作。

4. 吸附步驟中樣品成團(tuán)。

A． 確保樣品加入RNA純化板前已被裂解。

C． 減少樣品使用量。根據(jù)說明書使用適量大小的樣品。

D． 檢查 CLB Soluion，如果保存過程中出現(xiàn)沉淀，加熱至56°C 使沉淀溶解，降至室溫后使用。

5. 抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A． 來源于WBII Solution 的殘留乙醇會(huì)抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)的酶促反應(yīng)。RNA純化板~5600 × g 離心2 min，取覆膜后室溫靜置5 min，使RNA純化板中吸附膜上殘留的乙醇揮發(fā)。

B． 殘留鹽離子會(huì)抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)的酶促反應(yīng)。確保洗滌步驟在室溫下操作。