PUREfrex^® 酶無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒

PUREfrex^® 是一款單獨(dú)純化蛋白合成所需的因子后，與氨基酸和NTP等混合重組的蛋白合成試劑盒。通過(guò)減少試劑盒中的大腸桿菌來(lái)源脂多糖，合成的蛋白無(wú)需純化即可直接用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。對(duì)于初次想要嘗試本產(chǎn)品的用戶，本產(chǎn)品還可提供小包裝規(guī)格。

從減少塑料使用的環(huán)保觀點(diǎn)出發(fā)，并為了滿足需要更多反應(yīng)液的客戶需求，PUREfrex^® 試劑盒系列已停止生產(chǎn)5×250 µL反應(yīng)用（1.25 mL反應(yīng)用）規(guī)格的產(chǎn)品，并全新推出了“2 mL反應(yīng)用”規(guī)格的產(chǎn)品。

新規(guī)格與舊規(guī)格產(chǎn)品相比，反應(yīng)液的性價(jià)比更高。

◆關(guān)于PUREfrex^®

PUREfrex^® 是基于PURE system開(kāi)發(fā)的重組無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒。PURE system是東京大學(xué)的上田卓業(yè)教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的重組無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，是將轉(zhuǎn)錄、翻譯和能量回收所需的蛋白和核糖體單獨(dú)純化，然后與氨基酸、NTP等混合的合成系統(tǒng)。通過(guò)添加編碼目標(biāo)蛋白的DNA或mRNA至反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)來(lái)合成蛋白。由于使用了組分經(jīng)純化的混合反應(yīng)液，因此具有可自由調(diào)整其組成，且?guī)缀醪缓c翻譯等無(wú)關(guān)的蛋白的優(yōu)點(diǎn)。

PUREfrex^® 改良了反應(yīng)液中蛋白、核糖體和tRNA的制備方法，是一款與傳統(tǒng)產(chǎn)品相比，純度更高的合成反應(yīng)溶液。此外，大腸桿菌來(lái)源的污染性脂多糖含量降低至每µL反應(yīng)液10^-1 EU以下，并且 RNase和β-半乳糖苷酶等污染蛋白也有減少。此外，PUREfrex^® 的所有蛋白（包括翻譯因子等）中均不含純化和檢測(cè)用的標(biāo)簽。因此可合成添加了任何標(biāo)簽序列的蛋白，后續(xù)可利用該標(biāo)簽進(jìn)行純化和檢測(cè)。

使用PURE系統(tǒng)進(jìn)行蛋白合成的原理圖

◆特點(diǎn)

● 由經(jīng)純化組分組成的反應(yīng)液，非細(xì)胞提取液。

● 可以利用多種模板進(jìn)行反應(yīng)，還能合成Fab等多聚體。（多種模板混合下的Fab合成示例見(jiàn)下文）

● 可合成活細(xì)胞難以合成的強(qiáng)毒性蛋白。（蛋白毒性合成示例見(jiàn)下文）

● 模板DNA可直接添加至PCR反應(yīng)液使用。

● 反應(yīng)液量?jī)?nèi)合成的蛋白量幾乎恒定（數(shù) µL～數(shù) 10 mL）。

● 操作簡(jiǎn)便，僅需在單試管中37℃孵育數(shù)小時(shí)。

● 可合成帶標(biāo)簽的蛋白，用于下游純化和檢測(cè)。

◆使用PUREfrex^® 進(jìn)行蛋白合成的實(shí)驗(yàn)流程

◆PUREfrex^® 使用方法

通過(guò)下方鏈接查看視頻：

http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1610.html

實(shí)驗(yàn)方案示例

使用PUREfrex^®1.0 時(shí)，可使用任意體積的反應(yīng)液進(jìn)行蛋白合成。例如，20 μL時(shí)反應(yīng)液的制備方法如下所示。

1.  將SolutionⅠ在室溫~37℃下加熱1 min左右至充分融解，隨后置于冰上。

2.  將Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。

3.  將融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ輕輕渦旋后，離心并收集試管底部的內(nèi)容物。

4.  根據(jù)下述列表制備反應(yīng)液。（DNA添加量為每kbp 0.5-3 ng/ μL）

5. 在37°C的加熱塊或水浴中反應(yīng) 2~4 h，合成蛋白。^注2

6. 合成的蛋白可用于多種用途。^注3

注意事項(xiàng)

注1）模板DNA請(qǐng)根據(jù)目標(biāo)蛋白自行制備。

注2）如果在氣相恒溫器（如培養(yǎng)恒溫器）中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溶液的溫度上升需要花費(fèi)更多的時(shí)間，合成量會(huì)有所降低。

注3）通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)合成時(shí)，請(qǐng)用水稀釋反應(yīng)液后進(jìn)行電泳。

       詳情請(qǐng)通過(guò)鏈接查看：https://www.genefrontier.com/en/downloads/purefrex/?noredirect=en_US

注4）反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致活性降低，因此，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)用量較少時(shí)，建議少量分裝。少量分裝后，請(qǐng)將Solution Ⅱ和Solution Ⅲ用液氮或干冰/乙醇快速冷凍，并在-20°C 或 -80°C 下儲(chǔ)存。若不快速冷凍，而是直接放入注4-80℃緩慢冷凍，會(huì)導(dǎo)致核糖體（Solution Ⅲ）等因子失去活性。此外，為避免核酸酶污染，建議佩戴手套和口罩。

◆模板DNA設(shè)計(jì)

蛋白合成時(shí)，向本試劑盒Solution Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 的混合反應(yīng)液中添加模板DNA，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)。注意，制備適合PUREfrex^® 合成的模板DNA是蛋白合成的關(guān)鍵之一。詳細(xì)的制備方法請(qǐng)參閱模板DNA網(wǎng)頁(yè)：

https://www.genefrontier.com/en/faq/purefrex-template-dna/?noredirect=en_US

使用PUREfrex^® 設(shè)計(jì)適合蛋白合成的模板DNA時(shí)的要點(diǎn)

● 對(duì)于ORF整體：

基于大腸桿菌密碼子的使用頻率使用密碼子

將導(dǎo)致移碼的序列（如 X/XXY/YYYZ）替換為其他的密碼子

● 對(duì)于N端：

使用富含AT堿基的密碼子

開(kāi)始使用蛋氨酸后，應(yīng)立即盡可能避免使用脯-氨酸和甘-氨酸。

● 對(duì)于5’UTR區(qū)：

含SD序列（核糖體結(jié)合序列）

SD 序列上游含15 個(gè)或以上的富含AT堿基的序列

PUREfrex^® 2.0mini —適合初次使用的用戶

進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，需要考慮宿主、表達(dá)載體、誘導(dǎo)、不溶性等多種因素，初次使用PUREfrex^® 或初次嘗試無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的用戶可能會(huì)產(chǎn)生是否真的可以合成蛋白，或者即使成功合成，蛋白合成量是否太少的疑問(wèn)。

對(duì)于PUREfrex^® _，因?yàn)槿魏紊飦?lái)源蛋白的模板DNA組成均相同，所以無(wú)需考慮宿主或載體等因素。PUREfrex^® 2.0mini 附帶通用引物和詳細(xì)說(shuō)明，因此，適合初次使用的用戶嘗試合成所需的蛋白。

◆蛋白合成反應(yīng)液和添加劑的選擇

請(qǐng)根據(jù)用途選擇蛋白合成反應(yīng)液和添加劑。

蛋白合成反應(yīng)液

● PUREfrex^® 1.0

PUREfrex^® 1.0 已公開(kāi)反應(yīng)液組成，適用于產(chǎn)品定制等需要組成成分信息的研究。此外，雖然使用 PUREfrex^® 2.0 合成蛋白時(shí)的速度較快，但可能無(wú)法及時(shí)形成和折疊二硫鍵等導(dǎo)致不溶時(shí)，此時(shí)使用合成速度較慢的PUREfrex^® 1.0 效果可能更好。

反應(yīng)液組成請(qǐng)通過(guò)鏈接查看：

https://www.cosmobio.co.jp/product/uploads/document/GFK_PUREfrex_1.0_contents_Oct2016.pdf

● PUREfrex^® 2.0

PUREfrex^® 2.0 改良了PUREfrex^® 1.0 的反應(yīng)液組成，提高了蛋白合成效率，從而增加了反應(yīng)液內(nèi)的蛋白合成量。適用于需要合成大量蛋白及多種蛋白的研究。反應(yīng)液組成保密。

● 合成量對(duì)比數(shù)據(jù)（見(jiàn)下文）

● 添加劑效果對(duì)比（見(jiàn)下文）

● PUREfrex^® 2.1

PUREfrex^® 2.1 適用于需嚴(yán)格控制氧化還原狀態(tài)的含二硫鍵結(jié)合的蛋白合成。它在保留PUREfrex^® 2.0 反應(yīng)液組成的基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加了還原劑，因此可根據(jù)添加的還原劑（和氧化劑）種類和數(shù)量來(lái)調(diào)整合成過(guò)程中的氧化還原狀態(tài)。并且，還可用于探討適用于細(xì)胞中難以表達(dá)的含二硫鍵結(jié)合的蛋白合成條件。此外，作為添加劑的DsbC Set（原：DS supplement）和DnaK Mix也能加入反應(yīng)液中使用。

● AppA合成示例和IgG合成示例（見(jiàn)下文）

蛋白合成用添加劑

● DnaK Mix

DnaK Mix是經(jīng)高度純化的大腸桿菌來(lái)源的DnaK、DnaJ、GrpE蛋白以適當(dāng)?shù)臐舛缺壤A(yù)混后的溶液。

●GroE Mix

GroE Mix是經(jīng)高度純化的大腸桿菌來(lái)源的GroEL、GroES蛋白以適當(dāng)?shù)臐舛缺壤A(yù)混后的溶液。

此類分子伴侶混合物可有助活性蛋白的合成，而僅使用單個(gè)分子伴侶往往難以形成高階結(jié)構(gòu)。

目前還未明確哪種添加劑效果好，實(shí)際效果取決于需合成的蛋白。但如果是初次嘗試，推薦使用合成效果更廣泛的DnaK Mix。

● DsbC Set （原：DS supplement)

含有作為氧化谷胱-甘肽（GSSG）和二硫鍵異構(gòu)酶的大腸桿菌 DsbC。

● PDI Set

含有氧化谷胱-甘肽（GSSG）、人源二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和PDI的氧化酶Ero1α。

可為形成二硫鍵創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)環(huán)境。二硫鍵的形成可能只需要氧化劑GSSG，也可能需要具有二硫鍵異構(gòu)化活性的DsbC或PDI。氧化劑GSSG和Ero1α一樣也會(huì)氧化PDI，但它還可以氧化反應(yīng)液整體。另一方面，Ero1α 是一種特異性氧化PDI的酶，如果無(wú)需氧化整個(gè)反應(yīng)溶液時(shí)，建議使用Ero1α（PDI 組）。

● EF-P

大腸桿菌的翻譯因子之一，在合成含有連續(xù)脯-氨酸殘基的蛋白時(shí)添加，可以增加合成量。

◆產(chǎn)品數(shù)據(jù)

PUREfrex^®1.0 和2.0 的合成量對(duì)比

合成原核生物和真核生物來(lái)源蛋白的結(jié)果顯示，與PUREfrex^®1.0 相比，使用PUREfrex^® 2.0 合成時(shí)各種蛋白的合成量增加。

添加劑效果對(duì)比

使用單試管合成多個(gè)不同的模板DNA

在多模板混合條件下添加 DsbC Set（原 DS supplement）合成 Fab 的示例

在PUREfrex^® 2.0 的基礎(chǔ)上添加DS supplement合成的結(jié)果顯示，成功合成了由輕鏈（LC）和重鏈（HC）通過(guò)分子間二硫鍵相連而成de 活性Fab，且該活性Fab可以和抗原結(jié)合。另外，通過(guò)優(yōu)化輕鏈（LC）和重鏈（HC）的模板DNA的添加比例，結(jié)果顯示活性Fab的產(chǎn)量增加。（最高產(chǎn)量為0.5 mg/mL）

合成強(qiáng)毒性蛋白

蛋白毒素（Gelonin）的合成示例

a）使用PUREfrex^®2.0 合成Gelonium multiflorum植物種子來(lái)源的蛋白毒素的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示成功合成了具有蛋白翻譯抑制活性的毒素。

b）在HeLa 細(xì)胞來(lái)源的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中合成 GFP時(shí)， 通過(guò)比較添加合成了Gelonin蛋白的PUREfrex^® 反應(yīng)液（未純化）時(shí)的GFP活性，來(lái)確認(rèn)翻譯抑制的活性。(最高產(chǎn)量為0.5 mg/mL）

* Gelonin的分子量為30 kDa，通過(guò)滅活真核細(xì)胞的核糖體來(lái)抑制翻譯。

起始密碼子后的氨基酸密碼子對(duì)合成量的影響

曲-妥珠單抗重鏈（VH+CH1）的合成示例（替換起始密碼子后的密碼子）

使用PUREfrex^®2.0，通過(guò)用了起始密碼子后的第2~6個(gè)氨基酸處不同密碼子的56種模板 DNA 合成Trastuzumab 的重鏈（VH+CH1）。結(jié)果顯示，最高合成量和最少合成量間相差約50倍。合成量最高的模板 DNA 是使用低GC含量密碼子的模板 DNA（AT），合成量隨著 GC含量的增加而減少。此外，與大腸桿菌中使用頻率高的密碼子相比，通過(guò)使用了頻率低但GC含量少的密碼子的模板 DNA 進(jìn)行合成時(shí)，合成率更高。

通過(guò) PUREfrex^® 2.1 合成含二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白

1. 酸性磷酸酶（AppA）活性測(cè)試

使用DTT和GSH（還原型谷-胱甘肽）兩種還原劑與改變濃度的GSSG（氧化型谷-胱甘肽）和大腸桿菌的二硫化物異構(gòu)酶DsbC合成需要二硫鍵（SS鍵）的 AppA^*1，并比較其合成量和活性，結(jié)果顯示，雖然從還原凝膠的電泳分析中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)合成量的顯著差異，但活性根據(jù)使用的還原劑類型和濃度各異。

（*1 AppA有5個(gè)二硫鍵，其中一個(gè)為不連續(xù)的半胱-氨酸殘基間的二硫鍵。）

2. IgG的合成

通過(guò)添加 GSSG（氧化型谷-胱甘肽）、大腸桿菌的二硫鍵異構(gòu)酶 DsbC 和分子伴侶，并使用不同種類的還原劑，合成通過(guò)二硫鍵（SS 鍵）形成的兩條L鏈（輕鏈）和兩條H鏈（重鏈）的四聚體結(jié)構(gòu)IgG。比較其合成量和活性的結(jié)果顯示，雖然從還原凝膠的電泳分析中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)合成量的顯著差異，但活性根據(jù)使用得還原劑類型和濃度各異。

更多其他的無(wú)細(xì)胞蛋白合成示例的數(shù)據(jù)詳情請(qǐng)通過(guò)鏈接查看：

https://www.genefrontie.com/en/cases/purefrex/?noredirect=en_US

大量論文引用，詳情請(qǐng)通過(guò)鏈接查看：

https://www.genefrontier.com/en/publications/purefrex/?noredirect=en_US

查看相關(guān)產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 1.0：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1609.html

查看相關(guān)產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 2.0：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/933.html

查看相關(guān)產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 2.1：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1611.html


◆產(chǎn)品列表

蛋白合成反應(yīng)液PUREfrex^® 1.0

蛋白反應(yīng)溶液PUREfrex^® 2.0

蛋白反應(yīng)溶液PUREfrex^® 2.1

蛋白合成用添加劑DnaK Mix / GroE Mix

形成高階結(jié)構(gòu)，提高溶解度（分子伴侶）

蛋白合成用添加劑DsbC Set (原：DS supplement)

促進(jìn)二硫鍵形成

蛋白合成用添加劑PDI Set

促進(jìn)二硫鍵形成

蛋白合成用添加劑EF-P

用于含有連續(xù)脯-氨酸的蛋白合成

◆關(guān)于蛋白合成

Q1:是否可以合成人源蛋白等大腸桿菌以外的蛋白？

PUREfrex^® 是大腸桿菌來(lái)源的重組翻譯系統(tǒng)的蛋白合成系統(tǒng)，但也能合成哺乳動(dòng)物和植物等高等真核生物來(lái)源的蛋白。查看合成各種蛋白的實(shí)例：https://www.genefrontier.com/en/

然而， 根據(jù)GC含量和次要密碼子的出現(xiàn)頻率等核酸序列，可能會(huì)降低蛋白合成的效率。

比起蛋白來(lái)源，模板DNA的堿基序列或氨基酸序列可能會(huì)影響蛋白的合成量，通過(guò)優(yōu)化因果序列可以改善蛋白合成量。

Q2: 使用PUREfrex^® 的蛋白合成量是多少？

這個(gè)取決于合成的蛋白。例如，試劑盒附帶的對(duì)照模板DNA二氫葉-酸還原酶 (DHFR)使用PUREfrex^® 1.0 和PUREfrex^® 2.0 時(shí)，每毫升反應(yīng)液分別可合成約 150 µg和 600 µg。

Q3：是否可以合成和純化標(biāo)簽蛋白？

PUREfrex^® 中的所有蛋白均不含純化和檢測(cè)用的標(biāo)簽。因此，可以使用所有標(biāo)簽序列，如組-氨酸標(biāo)簽（His tag）。

His tag標(biāo)簽蛋白的純化方法請(qǐng)查看：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-09/

Q4：是否可以同時(shí)合成多種蛋白？

使用不同蛋白編碼的多個(gè)模板DNA，可在單試管中同時(shí)合成多種蛋白。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)模板DNA合成的蛋白量有差異時(shí)，可以通過(guò)調(diào)整模板 DNA 的添加量比例來(lái)調(diào)整蛋白合成量。

IgG 的輕鏈 (LC) 和重鏈 (HC)同時(shí)合成的結(jié)果請(qǐng)查看：https://www.nature.com/articles/s41598-018-36691-8

Q5：PUREfrex^® 可合成的蛋白分子量是多少？

多個(gè)殘基的肽可以合成分子量約為 100 kDa 的蛋白；β-半乳糖苷酶的合成示例請(qǐng)查看：

https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-05/

Q6：PUREfrex^® 是否含有分子伴侶？

PUREfrex^® 是一種僅包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所需因子的蛋白合成系統(tǒng)，因此不含分子伴侶。Gene Frontier推出了一系列可添加至 PUREfrex^® 中使用的分子伴侶，如 Hsp70（DnaK Mix：#PF003-0.5）和 Hsp60（GroE Mix：#PF004-0.5）。

Q7：是否能夠合成具有二硫鍵的蛋白（如抗體）？

可以合成。當(dāng)?shù)鞍仔枰蜴I才具有活性時(shí)，請(qǐng)向 PUREfrex^® 中加入添加劑 DsbC Set (#PF005-0.5) 或 PDI Set (#PF006-0.5)使用。建議使用已優(yōu)化合成條件的 PUREfrex^® 2.1 (#PF213-0.25) 。

抗體 (IgG, Fab, scFv)的合成示例請(qǐng)查看：https://www.nature.com/articles/s41598-018-36691-8

Q8：是否可以合成膜蛋白？

可以合成。但是，大部分情況下合成的膜蛋白會(huì)形成聚集。通過(guò)將脂質(zhì)體和納米盤等脂質(zhì)成分添加至PUREfrex^® 反應(yīng)液合成膜蛋白，或可合成含脂質(zhì)成分的膜蛋白。

查看使用納米盤的合成示例：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-11/

Q9：是否可進(jìn)行糖基化和N端修飾等翻譯后修飾？

PUREfrex^® 是一種僅重組轉(zhuǎn)錄和翻譯所需因子的蛋白合成系統(tǒng)，因此，無(wú)法單獨(dú)進(jìn)行糖基化和N端修飾等翻譯后修飾。但是，可以通過(guò)向反應(yīng)液添加翻譯后修飾酶及其底物來(lái)進(jìn)行翻譯后修飾。

關(guān)于糖基化的信息，請(qǐng)查看鏈接：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-19/

關(guān)于N端乙酰化和肉豆蔻?；男畔?，請(qǐng)查看鏈接：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-20/

Q10：是否可合成[35S] 蛋氨酸或 [3H] 亮-氨酸等放射性同位素標(biāo)記的蛋白？

通過(guò)添加含有[35S] 蛋氨酸或 [3H] 亮-氨酸等放射性同位素的氨基酸至合成反應(yīng)液進(jìn)行合成，可以合成放射性同位素標(biāo)記的蛋白。另外，PUREfrex^® 1.0 含有20種天然氨基酸，其最終濃度均已調(diào)至0.5 mM。

Q11：分泌蛋白的合成需要信號(hào)序列嗎？

使用 PUREfrex^® 合成時(shí)，不需要信號(hào)肽，但翻譯是從不會(huì)變成N端的序列開(kāi)始的，這可能會(huì)導(dǎo)致合成量降低。因此，建議優(yōu)化除信號(hào)序列以外的序列（尤其是N端）。詳情可查看模板DNA問(wèn)題1。

Q12：PUREfrex^® 的密碼子出現(xiàn)頻率與大腸桿菌相同嗎？

PUREfrex^® 使用從大腸桿菌中制備的tRNA混合物，各tRNA的濃度均反映了大腸桿菌中tRNA濃度。因此，大腸桿菌內(nèi)含量較低的tRNA在PUREfrex^® 反應(yīng)液中的含量也較低。

綜上，PUREfrex^® 合成蛋白的模板DNA建議使用與大腸桿菌使用頻率相匹配的密碼子。

此外，設(shè)計(jì)模板DNA時(shí)的注意事項(xiàng)請(qǐng)查看：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

Q13：PUREfrex^® 中表達(dá)的蛋白/肽的N端蛋氨酸是否甲酰化？如果是甲?；?，翻譯過(guò)程中和翻譯后是否會(huì)脫甲?；?？

使用 PUREfrex^® 合成的蛋白的N端蛋氨酸被甲?；⑶以诜g過(guò)程中和翻譯后也不會(huì)去甲?；?/span>

但是，根據(jù)合成的蛋白量的不同，甲?；w耗盡，合成的蛋白中可能會(huì)混有部分沒(méi)有甲酰化的蛋白。即使N端蛋氨酸未被甲?；?，PUREfrex^® 也能繼續(xù)進(jìn)行翻譯反應(yīng)，但根據(jù)合成的蛋白不同，可能會(huì)影響合成效率。

◆關(guān)于模板DNA

Q1：模板DNA的制備和優(yōu)化的要點(diǎn)是什么？

關(guān)于模板DNA的制備和優(yōu)化的要點(diǎn)請(qǐng)查看以下頁(yè)面。

關(guān)于模板DNA：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

模板DNA序列相關(guān)的6點(diǎn)注意事項(xiàng)：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

Q2：靶蛋白基因的上游需要什么序列？

模板DNA在編碼靶蛋白的基因上游至少需要T7啟動(dòng)子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD 序列）。

Q3:可以使用T7啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子嗎？

PUREfrex^® 的反應(yīng)液中含有作為轉(zhuǎn)錄酶的T7 RNA聚合酶，所以推薦使用含T7啟動(dòng)子的模板DNA。使用其他啟動(dòng)子時(shí)，需添加該啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

Q4: 5’UTR的序列可以改變嗎?

可以改變。但是，5’UTR序列會(huì)影響蛋白合成量，5’UTR序列對(duì)合成回收量的影響請(qǐng)查看下方鏈接：

https://www.genefrontier.com/files/p29_MBSJ2021.pdf

目前，GeneFrontier設(shè)計(jì)的5' UTR 序列的蛋白合成量較高。序列中各區(qū)域?qū)铣闪康挠绊懜鳟悾虼?，?qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整。

Q5：可以使用哪些終止密碼子？

PUREfrex^® 中所含的兩種翻譯終止因子（解離因子），與三種終止密碼子（UAG(amber)、UGA(opal)、及UAA(ochre)）相兼容，因此可以使用任意一種終止密碼子。

Q6：靶蛋白基因的下游需要什么序列？

使用環(huán)狀DNA時(shí)，編碼靶蛋白的基因下游需要終止轉(zhuǎn)錄的T7 終止序列。使用直鏈DNA時(shí)，請(qǐng)?jiān)诮K止密碼子的下游添加10個(gè)以上的堿基。此外，對(duì)于直鏈DNA，終止密碼子下游不一定需要T7終止序列。

Q7：當(dāng)使用兩步PCR制備PUREfrex^® 用的模板DNA時(shí)，對(duì)于”REV primer”是否存在“10個(gè)堿基以上的任意序列”的限制要求呢？

“REV primer”基本上是可任意選擇的，但是需要注意以下幾點(diǎn)。

● ORF部分的C端之后的"taatga "部分是2個(gè)終止密碼子并列的序列。

● 比起序列，長(zhǎng)度更重要。長(zhǎng)度小于10個(gè)堿基會(huì)影響合成效率；長(zhǎng)度大于10個(gè)堿基，即使是20個(gè)堿基也沒(méi)問(wèn)題。

● 應(yīng)盡可能避免在終止密碼子后放入可形成剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列（如高GC含量）。

● 例如，該部分可插入限制性酶切位點(diǎn)。

Q8：反應(yīng)溶液中應(yīng)該加入多少模板DNA？

無(wú)論是質(zhì)粒還是 PCR 產(chǎn)物，DNA的添加量均為每 kbp 0.5-3 ng/µL。

添加至PUREfrex^® 反應(yīng)液中的DNA以分子數(shù)（摩爾濃度）為基準(zhǔn)，添加后的最終濃度應(yīng)在2 nM 左右。例如，添加至反應(yīng)液中的DNA是長(zhǎng)度為6 kbp的質(zhì)粒（環(huán)狀DNA）時(shí)，則無(wú)論實(shí)際 ORF 長(zhǎng)度如何，添加量應(yīng)均為(0.5~3)×6 = 3~18 ng/µL。

Q9：模板DNA能否溶解于TE緩沖液中使用？

TE 緩沖液中所含的EDTA可能會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)，減少蛋白合成量。溶解DNA時(shí)，建議使用不含EDTA的緩沖液或Milli-Q水。

Q10：直接添加PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)注意什么？

為了減少?gòu)腜CR反應(yīng)液中引入鹽等物質(zhì)，添加量請(qǐng)不要超過(guò)PUREfrex^® 反應(yīng)液量的 1/10。PCR 反應(yīng)液中引入的污染會(huì)改變鹽濃度降低轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)的活性。

PCR產(chǎn)物濃度較低時(shí)，應(yīng)避免增加未純化PCR反應(yīng)液的添加量，可考慮使用DNA純化試劑盒等制備足夠濃度的DNA溶液。

【參考】使用PCR產(chǎn)物作為模板DNA使用時(shí)：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-02/

Q11:PCR產(chǎn)物所需的純度是多少？

如果在PCR后的電泳中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物以外的條帶時(shí)，請(qǐng)?zhí)接慞CR條件以抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于副產(chǎn)物也可能會(huì)合成蛋白，所以通過(guò)PCR獲得的條帶純度會(huì)影響蛋白的合成效率。當(dāng)改變PCR條件仍產(chǎn)生副產(chǎn)物時(shí)，需將目標(biāo)條帶從凝膠中切下并純化。從凝膠切下條帶時(shí)，為避免DNA損傷（可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），請(qǐng)不要使用紫外線照射。可以使用藍(lán)光，但應(yīng)盡量縮減照射時(shí)間。

【參考】使用PCR產(chǎn)物作為模板DNA使用時(shí)：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-02/

Q12：是否能使用人工合成的DNA作為模板？

含啟動(dòng)子序列的人工合成片段可以作為模板DNA使用。此外，也可以從僅合成ORF的DNA中，使用含有啟動(dòng)子序列等所需序列的引物，通過(guò)PCR來(lái)制備模板DNA。但是，根據(jù)基因合成生產(chǎn)商的不同，可能會(huì)在交付的產(chǎn)品中添加抑制蛋白合成反應(yīng)RNase。當(dāng)無(wú)法合成目標(biāo)蛋白時(shí)，可嘗試添加RNase抑制劑或嘗試使RNase滅活。

此外，對(duì)于以質(zhì)粒形式作為模板DNA，請(qǐng)查看使用質(zhì)粒作為模板DNA使用時(shí)的注意事項(xiàng)：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-03/

Q13：哪些質(zhì)粒載體可用作模板DNA？

可使用含有T7 promoter、SD 序列和 T7 terminator的載體。例如，pET型（Merck公司）、pQE型（Qiagen 公司）等。但是，存在lac operator序列時(shí)，可能會(huì)減少蛋白合成量，因此推薦使用不含lac operator序列的載體，如pET17等。

Q14：制備模板質(zhì)粒時(shí)應(yīng)該注意什么？

制備質(zhì)粒DNA 時(shí)，注意不要讓純化時(shí)添加至使用緩沖液的RNase活性殘留在最終純化物中。

例如，在使用膜型純化試劑盒（如 Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit或Promega 的Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System）時(shí)，Lysis buffer中所含的RNase A會(huì)混入最終純化的DNA溶液中。如果直接作為模板DNA添加至PUREfrex^® 反應(yīng)溶液中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等的RNA會(huì)被分解，抑制蛋白合成。

當(dāng)使用這種純化試劑盒純化的DNA溶液，可通過(guò)Phenol/Chloroform處理使RNase滅活，再通過(guò)乙醇沉淀等再次純化，即可制備不含RNase活性的DNA溶液?；蛘?，可在 PUREfrex^® 反應(yīng)液中添加RNase inhibitor來(lái)合成蛋白。另一方面， Qiagen的 Plasmid Mini Kit 在洗脫與樹(shù)脂結(jié)合的DNA后，向洗脫液添加isopropanol使DNA沉淀，可抑制RNase 活性污染。已確認(rèn)通過(guò)該試劑盒純化的質(zhì)?？芍苯邮褂?。

【參考】使用質(zhì)粒作為模板DNA的注意事項(xiàng)：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-03/

Q15：如何使用RNA作為模板？

使用mRNA合成蛋白時(shí)，請(qǐng)使用起始密碼子上游中包含SD序列的mRNA。另外，mRNA的添加濃度大約為0.1～1 µM。由于適用濃度因所用mRNA的序列和純度而異，建議參考上述濃度范圍，探討添加濃度的決定條件。