多重熒光免疫組化試劑盒-四色-100T主要用于組織的石蠟切片、TMA芯片的熒光法免疫組化染色。

作為Biogradetech-d家代理，艾美捷科技強烈推薦Biogradetech熱銷產(chǎn)品多重熒光免疫組化試劑盒-四色-100T。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

多重熒光免疫組化試劑盒-四色-100T檢測原理：

本試劑盒采用多標記免疫熒光染色技術(shù)，將抗原、抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)同酪胺信號放大技術(shù)相結(jié)合，選用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗抗體，對試劑盒中的熒光染料進行活化，將信號共價結(jié)合到抗原上。借助于不同的熒光染料標記，通過多輪染色實現(xiàn)組織或細胞單個樣本的原位多靶點染色。酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ，TSA 技術(shù)同樣采用 HRP 標記的二抗，同樣有對應的“顯色”步驟（HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的l氨酸等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體洗脫液洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復合物，重復下一種一抗-hrp 二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide 的過氧化物酶反應（酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結(jié)合位點），產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基（包括s氨酸、z氨酸和l氨酸殘基）結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的l氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用 TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。

染料使用方法：

TSA 熒光染料工作液=Tyramide reagent + Tyramide Amplification Buffer ；

Tyramide reagent：Tyramide Amplification Buffer =1:100 ；

Tyramide reagent與 Tyramide Amplification Buffer 的稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，最佳范圍為 1:50-1:200(1:100 大部分情況能得到最佳結(jié)果）；

一般建議若一抗孵育時間常溫 1h-3h 內(nèi)，建議稀釋比例 1:50-1:200, 若一抗孵育時間 4 度過夜（12h 或以上），建議稀釋比例 1:100-1:200 或更高。

存儲條件

1. 試劑盒有效期為12個月，開封后有效期3個月，請盡快使用。

2. 2~8℃避光保存，使用前室溫溶解并充分混勻。

3. 生產(chǎn)日期和失效日期見包裝標簽。

樣本要求

1.福爾馬林固定的組織蠟塊或切片，大塊組織或TMA均可。

2.樣本需緊貼載玻片，無褶皺、破損、劃傷或污漬。

3.樣本應大于1000個細胞。

4.蠟塊需包埋實體瘤組織。壞死瘤組織、細針穿刺物、細胞甩片樣本會影響染色效果。

5.建議使用10%中性福爾馬林固定組織，固定時間一般為18～24小時。

6.切片厚度為4um左右，請使用防脫載玻片。建議切片樣本在制備后一周內(nèi)進行多標記免疫熒光染

色。

7.石蠟切片樣本制備過程不要添加任何粘合劑。樣本應置于載玻片正面、中央位置。

設備耗材

1. 檢驗所需設備器材：熒光成像設備、通風櫥、微量移液器、恒溫干燥箱、微波爐、計時器等。

2. 檢測所需耗材器皿：免疫組化筆、抗原修復盒、染色缸、孵育濕盒、蓋玻片、洗瓶、量筒等。

試劑制備

1. 通用試劑：滅菌去離子水、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、抗原修復液、封閉液、TBST等。

2. 通過將Tyramide Amplification Bufer Plus PartA和PartB兩個組分等體積混合來制備1X的工作濃度緩沖液。為每個樣品準備 100ul工作液。

3. 試劑配制：單色TSA熒光染料使用信號放大反應液1:100稀釋制備工作液；DAPI使用無菌水1:100稀釋制備工作液，

現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. HRP標記二抗為工作液，直接使用，無需稀釋。請注意試劑盒中二抗反應性要求，標配為HRP羊抗兔二抗。

技術(shù)要點

1. 與直接使用染料-二抗偶聯(lián)物相比，使用Tyramide Amplification Kits 的免疫熒光成像通常顯示出更高的靈敏度和

更強的信號。因此，可以使用較低濃度的一抗，以盡量減少來自非特異性結(jié)合的背景光。我們建議進行一抗滴定以找到最佳濃度

2. 如果擔心背景熒光，我們建議并排運行未與一抗孵育的陰性對照。確保該陰性對照在孵育和洗滌期間不會被陽性樣品中的試劑交叉污染。對于組織樣本，我們還建議對未染色的對照(未添加抗體或酪胺)進行成像，以確定組織自發(fā)熒光對背景的影響。

3. 我們推薦使用5ug/mL 的 HRP 偶聯(lián)物。 降低濃度可能會損害信號強度和靈敏度。

4. 我們建議Tyramide reagent 按 1:100稀釋。更高的濃度除了可能得到更強的信號外，還可能導致更高的背景?？梢酝ㄟ^滴定(從 1:50 到1:500)為您的特定應用找到最佳濃度。

5. 通過在每次酪胺反應后進行 HRP 淬滅或抗體剝離，可以依次使用多個Tyramide reagent 標記同一樣品上的不同目標。共價連接到樣品上的染料或生物s將保留。

6. 在進行鏈霉親和素/生物s檢測時，我們建議阻斷樣品中的內(nèi)源性生物s以降低背景。

實驗流程

操作步驟

1)脫蠟水合 

a)新鮮二甲苯浸片5min，重復3次。

b)梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 5min。

c)滅菌水浸片1min，重復3次。

d)10%中性福爾馬林浸片10min（防止脫片），滅菌水浸洗切片1min，重復3次。（可選）

e)1~3% H2O2室溫孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。（可選）

f)滅菌水浸洗切片1min，重復3次。

2) 微波修復抗原 

a) 將脫蠟水合后的切片置于抗原修復盒中，加入足夠的1×抗原修復液。

b) 將抗原修復盒置于微波爐內(nèi)高火煮沸。

c) 低檔火力維持10~15min（注意補充抗原修復液，防止蒸發(fā)過度導致干片）。

d) 取出抗原修復盒，自然冷卻至室溫。

3) 封閉 

a) 切片用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復3次。

b) 去除切片上殘存洗液。

c) 用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域。

d) 室溫保濕輕微震蕩10~30min。

4) 一抗孵育 

a) 去除切片上的封閉液。

b) 滴加適量的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育1h（需針對不同抗體做優(yōu)化調(diào)整）。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復3次。

5) 二抗孵育 

a) 去除切片上殘存的洗液。

b) 直接滴加HRP標記二抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育10~30min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復3次。

6) 熒光染色放大信號

a) 去除切片上殘存的洗液。

b) 滴加適量1×染料工作液（單色TSA熒光染料用信號放大液1:100稀釋），浸沒樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育10~15min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復3次。

7) 微波修復降噪 

a) 按步驟2微波修復一次，室溫自然冷卻至室溫。

b) 滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

c) 單染結(jié)束，DAPI染色后封片觀察或從步驟3（封閉）開始追加后續(xù)染色。

8) DAPI染色 

a) 去除切片上殘存洗液，滴加DAPI工作液，室溫保濕震蕩孵育10~20min。

b) 1×TBST Buffer 浸洗切片，室溫3min。

c) 滅菌水浸洗切片2min。

9) 封片觀察 

a) 待切片微干，滴加增強型抗淬滅封片劑10~30μL。

b) 加蓋玻片，密封劑（如指甲油）封邊，防止樣本干燥。

c) 閱片，對染色后的組織切片在熒光成像設備中采集圖像、觀察并進行判讀。

結(jié)果判讀

1. 微波修復抗原、孵育時間及溫度的變化均有可能得出錯誤結(jié)果。

2. 在每次染色過程中，必須有陽性對照和陰性對照實驗同時進行。

3. 若對照實驗不能顯示正確的染色，則應判定該批次樣本的檢測結(jié)果無效。

局限說明

1. 免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果。

2. 陽性信號定位不正確即為假陽性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應，另外組織的某些特定成分也能導致假陽性。

3. 抗原修復方法不當或一抗效價降低、失效，均有可能導致假陰性結(jié)果。

4. 過度或不足的染色都可能影響結(jié)果的正確解釋。

5. 本試劑盒只在10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片上進行了驗證。

性能指標

1. 符合性：取符合性組織切片，經(jīng)相應的免疫組化實驗后，陽性對照染色結(jié)果為陽性，陰性對照染色結(jié)果為陰性。

2. 批內(nèi)重復性：取同一批次的試劑盒，檢測同一組織樣本切片3片，染色結(jié)果一致。

注意事項

1. 本試劑盒只用于免疫組化，不做其它用途。

2. 本試劑盒僅限于專業(yè)人員使用。

3. 應采用適當?shù)姆雷o措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

4. 超過有效期的試劑活性可能降低，導致假陰性結(jié)果，因此不得使用超過有效期的試劑。

5. 若將本試劑盒的染色組分與其它公司的產(chǎn)品混合使用，在染色過程中可能出現(xiàn)異常情況。

6. 脫蠟不c底，嚴重影響染色效果

7. 為了防止可能出現(xiàn)的假陰性、假陽性結(jié)果，實驗過程中需有陽性對照及陰性對照同時進行。

8. 使用本試劑盒染色中所產(chǎn)生的各種廢棄物都應按照《醫(yī)療廢物管理條例》進行處理。

Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細胞生物學、蛋白質(zhì)組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經(jīng)科學、血液分析和高通量藥物篩選等領域。

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