納米紅外光譜探測細(xì)胞外囊泡的結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性

摘要：細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞主動釋放的納米級膜囊泡。最初EVs被認(rèn)為是細(xì)胞碎片，并且因此被低估，但是EVs現(xiàn)在越來越被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，它們在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。EV是異質(zhì)性的，更好地了解EV的分子組成和異質(zhì)性是設(shè)計(jì)下一代生物傳感器以進(jìn)行早期疾病診斷和開發(fā)基于EV的新興療法的基礎(chǔ)，這已經(jīng)在癌癥診斷和治療中顯示出巨大的前景。傳統(tǒng)的方法不具有表征單個EVs個體的分辨率和靈敏度，因此破譯單個EV的結(jié)構(gòu)和組成仍然是難題。

布魯克納米紅外光譜儀（nanoIR）采用光熱誘導(dǎo)共振技術(shù)(AFM-IR)實(shí)現(xiàn)微小區(qū)域紅外信號的采集。紅外激光照射到樣品上，樣品吸收輻射光產(chǎn)生熱膨脹，這種熱膨脹引發(fā)探針的震蕩，通過監(jiān)控探針的震蕩強(qiáng)度獲得紅外吸收強(qiáng)度。AFM-IR利用原子力探針作為樣品紅外吸收的傳感器，實(shí)現(xiàn)了超高靈敏度的光譜和紅外成像探測，化學(xué)成像分辨能力可以達(dá)到10nm。近期，澳大利亞悉尼大學(xué)悉尼藥學(xué)院團(tuán)隊(duì)將納米紅外光譜方法引入到單個EV結(jié)構(gòu)的檢測中，展示了其在同一EVs和不同EVs群體之間揭示個體EVs異質(zhì)性的能力。此方法無標(biāo)記，能夠檢測單個EV中的脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和核酸。通過AFM-IR對EV組成和結(jié)構(gòu)的新認(rèn)識將有助于我們對EVs的生物學(xué)理解，并可用于疾病診斷和EVs療法的開發(fā)。相關(guān)研究成果以High-fidelity probing of the structure and heterogeneity of extracellular vesicles by resonance-enhanced atomic force microscopy infrared spectroscopy為題，發(fā)表在Nature Protocols上。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：為了驗(yàn)證納米紅外具有探測不同細(xì)胞類型囊泡的分子組成的能力，作者分別從兩個特征良好的hTERT轉(zhuǎn)化人蛻膜（DMSC23）和絨毛膜（CMSC29）間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞系中分離EVs，期望這兩種細(xì)胞系能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和組成不同的EVs。將含有EV樣品的液滴滴在基片（如ZnS, 云母或金等）干燥一晚，獲得待測樣品。通過分析紅外光譜的峰位和峰強(qiáng)，可以確定DNA（1050–1290 cm−1），RNA（1250–1380 cm−1），蛋白質(zhì)（1500–1750 cm−1）和磷脂（1000–1250 cm−1, 1730–1750 cm−1; 2800–3000 cm−1）的存在。

圖2 顯示了同一EV群體內(nèi)不同顆粒的異質(zhì)性。藍(lán)色標(biāo)記的較大囊泡的光譜表現(xiàn)出更強(qiáng)的1725 cm-1（脂肪酸）和1240 cm-1（磷脂）吸收，這與囊泡表面和內(nèi)部的脂質(zhì)和核酸數(shù)量增多相一致。表征RNA的1124 cm-1的吸收在不同囊泡中強(qiáng)度不同，表明這些EVs中含有不同數(shù)量的RNA核糖。這些數(shù)據(jù)表明AFM-IR有足夠的靈敏度揭示單個EVs分子組成在納米尺度上的差異。

圖3顯示了CMSC29和DMSC23細(xì)胞分離的EVs亞群的AFM-IR光譜和成像。酰胺I的吸收峰在1500 cm-1 – 1800 cm-1范圍，可歸因于不同濃度和類型的核酸。

圖4的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了AFM-IR 表征不同細(xì)胞類型EVs的能力。DMSC23 EV具有更強(qiáng)的1556 cm-1和1452 cm-1，分別為酰胺I和脂酰CH2基團(tuán)的彎曲振動；DMSC29 EV表現(xiàn)出來的1124 cm-1,1087 cm-1,1044 cm-1吸收則為磷脂、甘油三酯和膽固*醇酯的拉伸振動，來自于EV中的脂質(zhì)成分，屬于核糖核酸。

總結(jié)：作者使用AFM-IR以超高分辨率探測整個EV群體，亞群和個體EV的組成和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)納米紅外能夠測量相同EV群體中，或不同EV群體之間的單個EV分子組成的細(xì)微差異。作者預(yù)測，在不久的將來，EV的AFM-IR表征極有可能釋放EV作為診斷和治療工具的全部潛力。

本文轉(zhuǎn)載自布魯克納米表面儀器部

• 布魯克nanoIRAFM紅外原子力顯微鏡

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