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【CEM】通過微波輔助環(huán)閉合復(fù)分解反應(yīng)實現(xiàn)碳?xì)滏I合肽的自動化合成
檢測樣品:碳?xì)滏I合肽
檢測項目:碳?xì)滏I合肽
方案概述:利用LibertyBlue?自動化微波多肽合成儀,通過微波增強(qiáng)的固相多肽合成(SPPS)技術(shù),可以快速合成高純度的烴鍵合多肽。在不到4小時內(nèi),我們成功合成了一種促凋亡BID鍵合多肽衍生物,即BIDSAHB(BCL-2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定α螺旋)1,其純度達(dá)到了80%。同樣,一種促凋亡的BIM鍵合多肽,BIMSAHB2,也在不到4小時的時間內(nèi)制備完成,純度同樣為80%。
一、摘要
利用Liberty Blue™自動化微波多肽合成儀,通過微波增強(qiáng)的固相多肽合成(SPPS)技術(shù),可以快速合成高純度的烴鍵合多肽。在不到4小時內(nèi),我們成功合成了一種促凋亡BID鍵合多肽衍生物,即BID SAHB(BCL-2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定α螺旋)1,其純度達(dá)到了80%。同樣,一種促凋亡的BIM鍵合多肽,BIM SAHB2,也在不到4小時的時間內(nèi)制備完成,純度同樣為80%。
二、介紹
肽鍵合是穩(wěn)定α-螺旋的一種有效策略,而α-螺旋是決定各種肽和蛋白質(zhì)生物活性的重要結(jié)構(gòu)單元。3特別是碳?xì)滏I合技術(shù)已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的方法來穩(wěn)定α-螺旋,已經(jīng)產(chǎn)生了多個具有更高靶標(biāo)親和力和顯著增強(qiáng)抗蛋白酶能力的肽例子。4此外,一些碳?xì)滏I合的肽被證明比其未鍵合的類似物具有更大的細(xì)胞通透性和體內(nèi)活性2,5,這進(jìn)一步激發(fā)了將α-螺旋肽用于治療應(yīng)用的努力。6
碳?xì)滏I合的肽可以通過使用側(cè)鏈末端帶有烯烴的氨基酸進(jìn)行SPPS(固相多肽合成)制備,例如Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH(圖1左)7。在合成前綴鍵合的肽后,可以通過環(huán)閉合復(fù)分解反應(yīng)(RCM)使用Grubbs催化劑™第一代(圖1右)7制備鍵合變體。傳統(tǒng)的室溫合成鍵合肽通常是一個耗時的過程,20個氨基酸長度的肽需要超過30小時的合成時間。將微波能量應(yīng)用于碳?xì)滏I合肽的合成可以更有效地耦合,從而提高合成時間和高純度(CarboMAX)。8
圖1:(左)Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH;(右)Grubbs催化劑第一代
三、材料與方法
試劑
以下Fmoc氨基酸購自CEM公司(馬修斯,北卡羅來納州),并含有指示的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán):Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Boc), Ser(tBu), Trp(Boc)和Tyr(tBu)。Rink Amide ProTide™LL樹脂也購自CEM公司。Grubbs催化劑TM第一代、Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH、N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇(DODT)、三異丙基硅烷(TIS)和醋酸酐(Ac2O)購自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密蘇里州)。1,2-二氯乙烷(DCE)購自Alfa Aesar(哈弗希爾,馬薩諸塞州)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙酉迷(Et2O)、醋酸、高效液相色譜級水和乙腈購自VWR(西切斯特,賓夕法尼亞州)。LC-MS級水(H2O)和LC-MS級乙腈(MeCN)購自Fisher Scientific(沃爾瑟姆,馬薩諸塞州)。
肽合成:BID SAHB, Ac-EDIIRNIARHLA(S5)VGD(S5)LDRSIW-NH2
該肽(圖2)是在0.05mmol規(guī)模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的,使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂(0.19meq/g替代度)。Fmoc脫保護(hù)使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。耦合反應(yīng)使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行(CarboMAX)。8Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙?;舛嗽?/span>E的Fmoc脫保護(hù)后使用10% Ac2O在DMF中進(jìn)行。環(huán)閉合復(fù)分解鍵合反應(yīng)使用10mM Grubbs催化劑第一代(58mg)在DCE(7mL)中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統(tǒng)進(jìn)行,切割液為92.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT。切割后,用Et2O沉淀肽并過夜凍干。
圖2:碳?xì)滏I合的BID SAHB
肽合成:BIM SAHB, Ac-IWIAQELR(S5)IGD(S5)FNAYYARR-NH2
該肽(圖3)是在0.05mmol規(guī)模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的,使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂(0.19meq/g替代度)。Fmoc脫保護(hù)使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。耦合反應(yīng)使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行(CarboMAX)。8Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙?;舛嗽?/span>I的Fmoc脫保護(hù)后使用10% Ac2O在DMF中進(jìn)行。環(huán)閉合復(fù)分解鍵合反應(yīng)使用10mM Grubbs催化劑第一代(58mg)在DCE(7mL)中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統(tǒng)進(jìn)行,切割液為TFA/H2O/TIS/DODT。切割后,用Et2O沉淀肽并過夜凍干。
圖3:碳?xì)滏I合的BIM SAHB
肽分析
肽在配備PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析,該系統(tǒng)裝有Acquity UPLC BEH C8柱(1.7微米和2.1 x 100毫米)。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100單四極桿質(zhì)譜儀用于結(jié)構(gòu)測定。峰分析通過Waters MassLynx軟件完成。分離采用梯度洗脫,流動相為0.05% TFA在(i)H2O和(ii)MeCN中的混合物。
四、結(jié)果
使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進(jìn)行微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS),成功制備了BID SAHB目標(biāo)肽,純度達(dá)到80%(圖4)。
圖4:BID SAHB的UPLC色譜圖
使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進(jìn)行微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS),成功制備了BIM SAHB目標(biāo)肽,純度達(dá)到80%(圖5)。
圖5:BIM SAHB的UPLC色譜圖
五、結(jié)論
使用微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS)可以快速高效地合成碳?xì)滏I合肽。傳統(tǒng)的室溫下BID SAHB肽的合成需要超過35小時的合成時間來生成未鍵合的肽,并且還需要額外的3-6小時進(jìn)行鍵合。7通過微波增強(qiáng)的SPPS,在不到4小時內(nèi)即可合成純度為80%的鍵合肽。傳統(tǒng)的BIM SAHB肽的室溫合成需要33小時的人工操作時間,并且還需要額外的3-6小時進(jìn)行鍵合。7另一方面,微波增強(qiáng)的SPPS在不到4小時內(nèi)即可提供純度為80%的鍵合肽。
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