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蜂蜜中糖含量分析方法的確定及問(wèn)題分析
測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖
適用于該項(xiàng)目的國(guó)標(biāo)有GB/T 22221-2008和GB/T18932.22-2003, 實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有GB/T18932.22-2003標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的色譜柱，而GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的條件都能滿足，就先按照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行樣品前處理和儀器分析。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1儀器及試劑
Waters e2695液相色譜儀、2414示差折光檢測(cè)器；果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖均為分析純；乙腈，色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得，18MΩ•cm，25 ℃
2.2儀器分析條件—參照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定
色譜柱：CNW Athena NH2 (250mm×4.6mm, 5μm)；流動(dòng)相：乙腈：水=85：15；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；色譜柱溫度：40℃；檢測(cè)器溫度：40℃
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖用水溶解并定容至100mL，配成濃度為5g/100mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
由于是條件摸索階段，因此不急于配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，先配制一個(gè)較高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1g/100mL）用于確定儀器分析條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
3 遇到的問(wèn)題與分析
3.1 儀器分析條件的優(yōu)化及單標(biāo)確認(rèn)
按照上述儀器分析方法對(duì)濃度為1g/100mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖1。
從圖中可以看出，雖然4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中對(duì)應(yīng)出現(xiàn)4個(gè)色譜峰，但是卻存在以下幾個(gè)問(wèn)題：
（1） 該色譜條件下4種組分的分離時(shí)間較長(zhǎng)，4種組分*分離需要近35min，各組分之間的分離度較大，可以嘗試進(jìn)行條件優(yōu)化，縮短檢測(cè)時(shí)間；
（2） 相同濃度下4種組分的出峰響應(yīng)值相差較大，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)可以依據(jù)樣品中的含量適當(dāng)降低組分1或者增加其它組分的濃度；
（3） 基線噪音較大，不利于微量組分的分析，對(duì)樣品的定性和定量都會(huì)產(chǎn)生影響
針對(duì)上述問(wèn)題，決定先嘗試優(yōu)化儀器分析條件，縮短樣品測(cè)試時(shí)間?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在色譜柱和儀器的耐受范圍內(nèi)，由于是條件摸索階段，因此暫時(shí)先不調(diào)整，仍然采用該濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。分析條件中采用的是示差檢測(cè)器，該檢測(cè)器不允許進(jìn)行梯度洗脫，要改善分離條件縮短測(cè)試時(shí)間只能從流動(dòng)相上做文章，于是嘗試通過(guò)改變流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化。氨基色譜柱既可以用于正相模式反相模式，又可以用于反相模式，在正相模式下，可以代替硅膠柱使用；在反相模式下可用于碳水化合物的分析，尤其適用于糖類分析，本實(shí)驗(yàn)即是采用氨基色譜柱的反相模式進(jìn)行糖類分析。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微調(diào)流動(dòng)相中有機(jī)相的含量，各組分間的分離度有很大的變化。增加乙腈的比例能夠提高各組分間的分離度，但測(cè)試時(shí)間延長(zhǎng)；降低乙腈的比例會(huì)降低各組分的分離度，但卻很大程度上縮短了測(cè)試時(shí)間。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈：水=75：25時(shí)，4種糖的測(cè)定時(shí)間縮短至15 min，同時(shí)4種糖具有較好的分離度。
上述測(cè)試過(guò)程中使用的是4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)峰對(duì)應(yīng)的待測(cè)組分還是未知的，因此在該儀器分析條件下先對(duì)各組分進(jìn)行單標(biāo)確認(rèn)。
在單標(biāo)確認(rèn)的過(guò)程中又發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)問(wèn)題：
（1） 雖然混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個(gè)*分離的色譜峰，但是對(duì)比單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn)，每個(gè)單標(biāo)色譜圖中都出現(xiàn)了兩個(gè)峰， 而4min附近色譜峰的峰面積和峰高幾乎 一致，很有可能是溶劑峰；
（2） 如果4min附近的色譜峰是溶劑峰，那么4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中實(shí)際上只分離出了3種組分，有一種組分沒(méi)有出峰或者與其他組分的保留時(shí)間接近；
（3） 對(duì)比葡萄糖和麥芽糖的單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn)，兩者的保留時(shí)間*一致，可能是操作有誤，兩者組分在配制或在進(jìn)樣時(shí)弄錯(cuò)了。
針對(duì)上述問(wèn)題逐一進(jìn)行排查，由于所用的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液是用水配制和稀釋的，4min附近的色譜峰是否是溶劑峰只需進(jìn)一針?biāo)畼蛹纯桑虼耸紫纫约兯疄闃悠愤M(jìn)行進(jìn)樣測(cè)試，并且重新配制葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液并測(cè)試，配制和進(jìn)樣過(guò)程及其仔細(xì)防止中間環(huán)節(jié)出錯(cuò)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4min附近的色譜峰為溶劑峰（見圖4），同時(shí)重新測(cè)定后葡萄糖和麥芽糖的保留時(shí)間仍然*一致。
葡萄糖和麥芽糖的保留時(shí)間一致，考慮是否是儀器分析方法不合適導(dǎo)致這兩種組份沒(méi)有分離？在前面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，微調(diào)流動(dòng)相比例4種糖的保留時(shí)間會(huì)有很明顯的變化，于是嘗試通過(guò)改變流動(dòng)相的方式進(jìn)行分離，然而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)改變流動(dòng)相兩者的保留時(shí)間是同步變化的。實(shí)驗(yàn)遇阻，就去查資料。百度一下葡萄糖和麥芽糖基本信息和結(jié)構(gòu)（見圖5），兩者的分子式和結(jié)構(gòu)都有很大的差別。然后去查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)采用氨基柱分離葡萄糖和麥芽糖的文獻(xiàn)并不少見?？磥?lái)是人品與技術(shù)的問(wèn)題了。
難道是色譜柱的原因？色譜柱柱效下降導(dǎo)致兩者不能分離？于是更換新的色譜柱再次分離，結(jié)果還是沒(méi)有能夠?qū)烧叻蛛x。如果葡萄糖和麥芽糖無(wú)法分離，實(shí)驗(yàn)便無(wú)法進(jìn)行下去，在經(jīng)過(guò)上述嘗試之后將問(wèn)題的矛頭指向了所用的試劑。查試劑臺(tái)賬，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室里還有其他品牌分析純的葡萄糖，而麥芽糖*一瓶，但是幸運(yùn)的是發(fā)現(xiàn)了葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品，決定使用麥芽糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品試一下。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間保持一致，而采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間出現(xiàn)了差異。總算是苦盡甘來(lái)找到了問(wèn)題的癥結(jié)，看來(lái)這次是 “李逵”遇到了“李鬼”。重新配制4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述儀器分析條件進(jìn)行測(cè)定時(shí)4種糖得到了較好的分離，因此繼續(xù)延用上述的儀器分析條件進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。
3.2 溶劑效應(yīng)的消除
4種糖的分離和確認(rèn)過(guò)程基本完成，接下來(lái)解決溶劑效應(yīng)的問(wèn)題。溶劑效應(yīng)在液相分析中是一種很常見有時(shí)也是很讓人頭疼的現(xiàn)象，嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)可能會(huì)影響到分析結(jié)果。溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的原因和處理方法早有前輩進(jìn)行過(guò)細(xì)致的講解（想了解更多可以參看帖子，這里也不過(guò)多的贅述。雖然此次的溶劑效應(yīng)不會(huì)影響定性和定量，但是那“高高再上”的溶劑峰看著很難受，于是想嘗試解決或者減輕溶劑效應(yīng)，降低溶劑峰的峰響應(yīng)。為了減少分析時(shí)間，同時(shí)減少標(biāo)準(zhǔn)品的消耗（麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品只有0.25g/瓶）決定直接用流動(dòng)相中的兩相（乙腈和水）進(jìn)行嘗試。通過(guò)改變乙腈和水的體積比考察溶劑峰的出峰情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述色譜條件下以乙腈為樣品進(jìn)行測(cè)試時(shí)溶劑峰為響應(yīng)值很大的倒峰；以水為樣品進(jìn)行測(cè)試時(shí)溶劑峰為響應(yīng)值很大的正峰；調(diào)節(jié)兩者的比例可以改變?nèi)軇┓宓某龇迩闆r，如圖7。
從圖中可以看出， 試樣為70%乙腈和80%乙腈時(shí)溶劑峰已經(jīng)變小許多，而以流動(dòng)相為樣品(75%乙腈)時(shí)溶劑效應(yīng)得到了進(jìn)一步的降低，也就是人們常說(shuō)的，可以嘗試用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或者定容樣品減輕溶劑效應(yīng)。于是決定采用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，然而在配制過(guò)程中又遇到了難題，高濃度糖的水溶液與乙腈不能互溶，兩者會(huì)出現(xiàn)明顯的分層，如圖8（照片拍的不是很清楚，但是可以看到一個(gè)分界線）。真是一波還未平息，一波又來(lái)侵襲?？磥?lái)采用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式是行不通了，于是適當(dāng)提高水相的比例，當(dāng)采用50%乙腈水溶液時(shí)，兩相沒(méi)有出現(xiàn)分層，同時(shí)測(cè)定時(shí)有效地降低了溶劑效應(yīng)，因此在后續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品前處理過(guò)程中均采用50%乙腈水溶液。
3.3 基線噪音的消除
優(yōu)化完儀器分析條件并解決了溶劑效應(yīng)問(wèn)題之后，接下來(lái)就要解決基線噪音的問(wèn)題了。液相中產(chǎn)生基線噪音的原因有：(1) 燈能量下降；（2）流通池污染；（3）泵壓不穩(wěn)；（4）氣泡等。論壇中關(guān)于基線噪音的帖子也很多，許多老師都對(duì)基線噪音產(chǎn)生的原因和消除方法進(jìn)行過(guò)詳細(xì)的介紹，這里僅列舉一二。
于是按圖索驥，依據(jù)論壇中介紹的消除基線噪音的方法分別對(duì)單向閥、色譜柱、樣品池和參比池等進(jìn)行維護(hù)，然后再對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果都沒(méi)有能夠得到理想的色譜圖，基線噪音依舊很大?？紤]到前期測(cè)定時(shí)流動(dòng)相微調(diào)會(huì)對(duì)樣品出峰有很大影響，同時(shí)依據(jù)示差檢測(cè)器的檢測(cè)原理（示差檢測(cè)器是連續(xù)檢測(cè)樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測(cè)器），該檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的變化和溫度都很敏感，而實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相都是通過(guò)比例閥在線混合的方式進(jìn)行的，在線混合不僅可能導(dǎo)致流動(dòng)相組成會(huì)有微弱的差異，同時(shí)乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化，因此嘗試采用流動(dòng)相預(yù)先混合的方式，即按照在線混合優(yōu)化后的比例進(jìn)行預(yù)先配制流動(dòng)相然后進(jìn)行測(cè)試，采用該方法后基線噪音得到明顯改善。關(guān)于基線噪音消除方法將另開一貼進(jìn)行詳細(xì)介紹。
3.4色譜柱的修復(fù)
經(jīng)過(guò)上述一系列的優(yōu)化和測(cè)試，蜂蜜中4種糖的測(cè)定方法基本確定，按照zui終優(yōu)化的方法進(jìn)行樣品前處理、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析測(cè)定。然而在后期的測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，氨基柱的性能下降很快，峰明顯變寬，柱效降低，如圖10。系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試表明，經(jīng)過(guò)幾番測(cè)試后氨基柱的柱效只用新柱的約三分之一。
采用隨柱說(shuō)明書（見圖11）提供的方法進(jìn)行維護(hù)：先用20倍乙腈沖洗，接著用異丙醇過(guò)渡，然后用二氯甲烷沖洗色譜柱，zui后再用異丙醇過(guò)渡回來(lái)，用流動(dòng)相沖洗、平衡色譜柱后進(jìn)樣分析，測(cè)試發(fā)現(xiàn)維護(hù)后色譜柱性能并沒(méi)有多大變化。
平時(shí)實(shí)驗(yàn)中C18色譜柱用的比較多，前期也對(duì)C18色譜柱進(jìn)行過(guò)修復(fù)實(shí)驗(yàn)并取得了很好的效果，此次也決定試一下。于是拆柱，拆開色譜柱后發(fā)現(xiàn)氨基柱的前端填料有點(diǎn)塌陷，于是從同款舊柱子的末端取了一些填料進(jìn)行填補(bǔ)，同時(shí)對(duì)前端的篩板進(jìn)行了清洗，如圖12。經(jīng)過(guò)填料的修補(bǔ)和篩板的清洗，色譜柱的柱效略有提高，但是與新柱相比還是相差甚遠(yuǎn)。在“液相色譜之家”群中和各位老師交流以及后期的學(xué)習(xí)過(guò)程中了解到：氨基柱是在高純球形硅膠基質(zhì)上鍵合氨丙基團(tuán)，采用氨基柱分析糖時(shí)通常會(huì)用到水相,而氨丙基團(tuán)遇水易水解，從而導(dǎo)致柱效下降。當(dāng)用到酸性流動(dòng)相時(shí)，流動(dòng)相pH值越低、流動(dòng)相中水的比例越高越容易發(fā)生水解，這種損傷是不可逆的，會(huì)導(dǎo)致色譜柱的報(bào)廢。
4 小結(jié)
（1）實(shí)驗(yàn)中之所以采用分析純的試劑配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液是因?yàn)榍捌诘臏?zhǔn)備工作做的不是很充分，儲(chǔ)備的標(biāo)準(zhǔn)品種類不全，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品含量太少，不足以前期方法摸索階段的消耗，因此才會(huì)出現(xiàn)麥芽糖的“李逵”和“李鬼”事件；
（2）流動(dòng)相在線混合的方式雖然會(huì)引起基線噪音，但是在前期方法摸索階段，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化時(shí)還是方便可行的，可以通過(guò)此方法摸索出合適的流動(dòng)相比例后再采用預(yù)混的方法進(jìn)行測(cè)定；
（3）此次氨基柱維護(hù)和修復(fù)的結(jié)果都不是很成功，但是使用過(guò)程中氨基柱性能下降的問(wèn)題依然存在，對(duì)氨基柱更好的使用和維護(hù)方法還在摸索階段，其他版友如有良策歡迎共同探討。