Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是用來定量檢測(cè)二次感染登革熱病毒（1~4型）IgG抗體的方法。可以作為診斷二次感染登革熱的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)輔助手段，能與登革熱IgM捕獲ELISA法聯(lián)合應(yīng)用來鑒別初次感染或是二次感染。這個(gè)方法僅能用來檢測(cè)具有臨床登革熱癥狀的病人的樣本。陽性結(jié)果必須經(jīng)病毒分離、雙份血清分析、免疫組織化學(xué)檢測(cè)抗原或病毒核酸檢測(cè)證實(shí)有登革熱病毒感染。

登革熱病毒是一種黃病毒屬，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)。世界上一半人口生活在這些地區(qū)，處在登革熱傳染的危險(xiǎn)之下。就其引起人類的發(fā)病率和死亡率來論，登革熱已成為zui重要節(jié)肢動(dòng)物疾病。有4種不同的、但在抗原學(xué)上相關(guān)的登革熱病毒類型。它通過雌性蚊子，特別是埃及伊蚊、白紋伊蚊和波利尼西亞伊蚊來傳播。

登革熱病毒感染的臨床表現(xiàn)多種多樣，從亞臨床癥狀到死亡。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度可以分級(jí)如下：非特異性熱性疾病、典型的登革熱、登革出血熱（DHF）（I級(jí)和II級(jí)）和登革休克綜合癥（III 級(jí)和IV級(jí)）。典型的登革熱表現(xiàn)為突然發(fā)熱伴隨著兩種或更多種的癥狀：頭痛、后眼眶痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、出疹、出血表現(xiàn)以及白細(xì)胞減少癥。雙相熱型、失眠和由于味覺喪失或苦味引起的食欲不振都很常見。DHF和DSS很嚴(yán)重，是經(jīng)常伴隨著第二種血清型感染而出現(xiàn)的可能會(huì)致死的并發(fā)癥。

在登革熱流行的那些國(guó)家，大多數(shù)病人會(huì)有二次感染?？贵w的檢測(cè)有助于診斷，特別是二次和繼后的感染，那時(shí)并發(fā)癥的發(fā)生率很高。一般地，血凝反應(yīng)-抑制（HAI）滴度用來分類初次感染或是二次感染。目前結(jié)果的確定依賴于至少7天內(nèi)及時(shí)分離得來的配對(duì)血清樣本的分析，HAI滴度≥ 1:2560的急性樣本確定為來自第二次黃病毒屬感染的病人。然而，根據(jù)HAI分類登革熱病例的普遍適用性由于血凝素在不同實(shí)驗(yàn)室的可變性而受到了質(zhì)疑。

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是一種替代HAI分析登革熱二次感染血清學(xué)診斷的有效方法，因?yàn)樗ㄟ^使用標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)減少了登革熱血清在實(shí)驗(yàn)室間的變異。不像HAI，不需要用丙酮萃取血清，如果得到了陽性結(jié)果，血清也無須出院后獲得。登革熱二次感染表現(xiàn)為感染發(fā)作后1~2天出現(xiàn)可檢測(cè)的高IgG水平，這可能伴隨有IgM水平的升高。高IgG水平（>22Panbio單位）因此作為登革熱病毒二次感染的標(biāo)志。

血清IgG抗體和包埋在微孔板測(cè)試帶（測(cè)定板）聚苯乙烯表面的抗-人IgG抗體相結(jié)合。在每個(gè)含有登革熱病毒抗原（1~4型）的抗原瓶中加入抗原重組緩沖液。在重組抗原中加入相同體積的辣根過氧化物酶（HRP）-結(jié)合單克隆抗體（MAb）,形成抗原-Mab復(fù)合物。沖洗走測(cè)定板上的殘存血清，加入復(fù)合的抗原-Mab。然后抗原-Mab復(fù)合物和血清登革熱-特定IgG抗體結(jié)合。孵育后，沖洗微孔板，再加入無色底物，四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫TMB/H2O2。底物被HRP水解，如果有的話，那色原體就會(huì)變成藍(lán)色。用酸終止反應(yīng)后，TMB變成黃色。顏色的變化是測(cè)試樣本中存在抗-登革熱IgG抗體的標(biāo)志。

1．抗-人IgG-包埋的微孔板-（綠色的測(cè)定板）（12＊8個(gè)孔）。備用。沒有用過的微孔應(yīng)立即重新密封好，貯存在有干燥劑的地方。在2-8oC穩(wěn)定至失效。

2．裝在瓶中的穩(wěn)定的登革熱抗原-1、2、3、4型登革熱病毒抗原凍干在小瓶中。沒有用過的凍干的抗原應(yīng)該貯存在2-8oC。重組抗原能冷凍保存和解凍一次。凍干抗原在2-8oC穩(wěn)定至失效。

3．洗滌緩沖濃縮液-一瓶60ml裝，吐溫20和防腐劑（0.1% ProclinTM）20倍濃縮的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2-7.6。[在低溫下可能會(huì)形成結(jié)晶。為避免這種情況，把它放在37度直至變得透明。充分混勻。]在1份洗滌緩沖濃縮液加入19份蒸餾水稀釋。稀釋的緩沖液在2~25oC可以貯存一個(gè)星期。

4．血清稀釋液-兩瓶50ml裝（粉紅色）。備用。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水pH 7.2-7.6 含防腐劑（0.1% Proclin）和添加劑。在2~8度保持穩(wěn)定直至失效。

5．抗原重組緩沖液-一瓶7ml裝（透明色）。備用。緩沖液含有防腐劑（0.1% Proclin）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

6．辣根過氧化物酶結(jié)合單克隆抗體示蹤劑-一瓶7ml裝（綠色）。備用。辣根過氧化物酶結(jié)合單克隆抗體示蹤劑含防腐劑（0.1% Proclin.）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

7．四甲基聯(lián)苯胺 TMB-一瓶15ml裝。備用。3,3,5,5''-TMB和枸酸鹽緩沖液（pH 3.5-3.8）內(nèi)的過氧化氫的混合物。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

8．IgG反應(yīng)對(duì)照血清-一個(gè)紅色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

9．IgG標(biāo)準(zhǔn)血清-一個(gè)黃色有蓋瓶子裝有400µL人血清（內(nèi)含0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

10．IgG陰性對(duì)照血清-一個(gè)綠色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

11．終止液-一個(gè)瓶子15ml裝。備用。1M磷酸。在2~25oC保持穩(wěn)定直至失效。

Proclin. 300是RohmHaas公司的注冊(cè)商標(biāo)產(chǎn)品

預(yù)警：

在這些成份里疊氮化納的濃度是有毒性的，是屬于下列級(jí)別R22, R32的：“吞食有毒"和“和酸接觸會(huì)釋放出有毒氣體"

另外必需具備但不提供的材料：

1．精確可調(diào)節(jié)微量移液器（5-1000µL容量），配備一次性使用吸管

2．去離子水

3．微量培養(yǎng)板洗滌系統(tǒng)

4．酶標(biāo)儀配備450nm濾波片

5．計(jì)時(shí)器

6．刻度量筒

7．燒瓶

8．血清稀釋用的試管或微量滴定板

警示: 用于體外診斷用

i 用在準(zhǔn)備對(duì)照時(shí)的所有人類來源的材料在測(cè)試對(duì)人類缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗體時(shí)，都為陰性。但是沒有哪種方法能夠*保證，所以所有的人體對(duì)照和抗原都應(yīng)該認(rèn)為是潛在的感染源。疾病預(yù)防控制中心和國(guó)家健康署建議可能傳染的抗原應(yīng)該在2級(jí)生物安全下進(jìn)行處理。

ii 這種測(cè)試只能用血清。用全血、血漿或是其它的樣本間質(zhì)不能做。

iii 黃疸的或黃體脂蛋白血清，或表現(xiàn)出溶血的，或有細(xì)菌生長(zhǎng)的血清都不可用。

iv 不要加熱失活的血清。

v 在開始實(shí)驗(yàn)前，所有的試劑必須要平衡至室溫（20~25oC）。試驗(yàn)受到室溫變化的影響。只有達(dá)到了室溫才能把微孔板從密封包里拿出來。

vi 用干凈的槍頭直接在瓶子里配試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能會(huì)導(dǎo)致污染。

vii 未用過的微孔板，應(yīng)立即重新封存，并儲(chǔ)存有干燥劑的地方。如果不這樣做可能會(huì)造成錯(cuò)誤的結(jié)果。

viii 底物系統(tǒng)

a 由于TMB易受金屬離子污染影響,所以不允許底物系統(tǒng)和金屬表面接觸。

b 避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于陽光直射下。

c 一些洗滌劑可能會(huì)干擾TMB的表現(xiàn)。

d TMB可能會(huì)有一些淡藍(lán)色。這個(gè)不會(huì)影響底物的活性或者試驗(yàn)的結(jié)果.

警告

為獲得更多的安全信息請(qǐng)參照從PANBI0得到的原料安全數(shù)據(jù)表（MSDS）.

標(biāo)本收集和準(zhǔn)備

讓靜脈血在室溫下（20~25oC）凝結(jié)成塊，然后根據(jù)全國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)NCCLS（收集診斷靜脈血的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)程序，H3-A4, 1998）進(jìn)行離心。

血清應(yīng)盡快分離并冷藏（2~8oC），如果在兩天內(nèi)不試驗(yàn)的話，就應(yīng)該冷凍（-20oC或更低的溫度）。不推薦使用自我解凍的致冷機(jī)。黃疸血清、有溶血的、脂血的或是有細(xì)菌生長(zhǎng)的血清都不推薦使用。CLSI提供貯存血樣的建議。（血樣處理加工的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)程序，H18-A2, 1999）。

測(cè)試程序：

注意：確保在實(shí)驗(yàn)前，所有的試劑都平衡至室溫（20~25oC）。在超出所提供的時(shí)間和溫度范圍內(nèi)試驗(yàn)可能會(huì)導(dǎo)致無效的結(jié)果。沒有在即定的時(shí)間和溫度內(nèi)進(jìn)行的試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)一次。

血清預(yù)稀釋：

i 從箔袋內(nèi)拿出所需數(shù)量的微孔板，并插入夾板固定器。5個(gè)板分別是陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物。確保剩下未用的微孔板緊緊地密封在箔袋內(nèi)。

ii 用合適的試管或微量滴定板稀釋陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)物和病人樣品。

a 在10µL血清中加入1000µL血清稀釋液。充分混勻。或者

b 在10µL血清中加入90µL血清稀釋液。取出20µL稀釋的血清加入180µL血清稀釋液。充分混勻。

EELISA操作步驟：

對(duì)方法的概括參見附圖

a    穩(wěn)定的抗原瓶。

i                 從試劑盒內(nèi)取出所需的凍干抗原瓶。每瓶可足夠2條帶16個(gè)孔使用。在每瓶?jī)?nèi)各加入1ml的抗原重組緩沖液。混勻確?？乖芙狻Ｈ绻旰玫闹亟M抗原沒有用過，將它保存在-80oC直至所需。確保剩下沒用的重組抗原貯存在2~8oC。

ii               取出所需量的重組抗原，然后在一個(gè)干凈的玻璃或塑料瓶里混合相同體積的MAb 示蹤劑。輕輕地混勻抗原和MAb示蹤劑溶液，再在室溫下保持至所需時(shí)。為測(cè)試板總量微孔準(zhǔn)備足夠的抗原瓶，也即每瓶抗原可夠16個(gè)孔（2條帶）使用。

b    測(cè)試板

i                 混勻后10分鐘內(nèi)，吸取100µL稀釋的病人樣本和對(duì)照，分別加入測(cè)試板相應(yīng)的微孔內(nèi)。

ii               蓋上測(cè)試板，在37°C±1°C孵育1小時(shí)。

iii             用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）。

iv              混勻抗原和MAb示蹤劑。吸取100 µL混勻物，加入測(cè)試板相應(yīng)的孔內(nèi)。

v                蓋上測(cè)試板，在37°C±1°C孵育1小時(shí)。

vi              用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）。

vii            在每個(gè)孔內(nèi)加入100 µL TMB。

viii          從*次加入算起，在室溫下20-25°C 孵育10分鐘。將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。

ix              按TMB加入的時(shí)間和順序，在所有的孔內(nèi)加入100 µL終止液?；靹?。藍(lán)色將會(huì)變成黃色。

x                30分鐘內(nèi)讀數(shù)，波長(zhǎng)450nm，參照濾波器600~650nm。

注意：如果是雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，在600~650nm間設(shè)定參照濾波。如果在450nm讀數(shù)沒有參照濾波時(shí)，可能會(huì)由于背景因素出現(xiàn)更高的吸光值。

有效的沖洗能去除沒有混合的樣品或成分，這對(duì)于ELISA程序是很有必要。

A．全自動(dòng)沖洗板

1 吸光所有孔內(nèi)容物。

2 在沖洗過程中，洗滌緩沖液要注滿孔（350 µL）

3 6次沖洗完后，把板翻轉(zhuǎn)，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

4 全自動(dòng)沖洗板一定要維護(hù)好，確保沖洗效果。在所有時(shí)間內(nèi)都要遵照制造商的沖洗說明。

B. 人工沖洗

1 把內(nèi)容物倒入合適的廢物缸。

2 用一個(gè)合適的擠壓瓶把洗滌緩沖液加滿孔，避免起泡，因?yàn)檫@可能會(huì)降低沖洗效果。立即倒掉緩沖液。

3 重新加滿，再立即倒掉。

4 再重復(fù)4次步驟3。總共用洗滌緩沖液洗6次。

5 洗完zui后一次后，倒掉孔內(nèi)容物，把板翻轉(zhuǎn)，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

每個(gè)試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)物，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照血清。在隨附的說明表列有這些血清合適值。那陰性和陽性對(duì)照是用來監(jiān)測(cè)由試劑引起的失敗。陽性對(duì)照不能確保試驗(yàn)臨界點(diǎn)的精確度。如果對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值沒有達(dá)到說明書標(biāo)準(zhǔn)，則測(cè)試無效，就應(yīng)該重做。如果測(cè)試無效，病人結(jié)果就不能報(bào)告。質(zhì)量控制需要必須遵照當(dāng)?shù)氐?、州?或國(guó)家法律或委任書和你們實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量程序。

建議用戶參照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202c中的合適的質(zhì)量控制實(shí)踐指導(dǎo)。

1 計(jì)算三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物的平均吸光度值。這是臨界值。

2 樣品的吸光度除以臨界值就得到指數(shù)值。

或者

3 指數(shù)值乘以10就得到Panbio 單位。

指數(shù)值=樣品的吸光度/臨界值

例如：樣品A的吸光度=0.949

樣品B的吸光度=0.070

臨界值=0.302

樣品A 0.949/0.302=3.14指數(shù)值

樣品B 0.070/0.302=0.23指數(shù)值

Panbio 單位=指數(shù)值 X 10

樣品A 3.14 X 10 = 31.4 Panbio 單位

樣品B 0.23 X 10 = 2.3 Panbio 單位

結(jié)果解釋：

登革熱IgG捕獲ELISA法檢定二次登革熱病毒感染病人血清中IgG抗體水平。陽性結(jié)果（> 22 Panbio 單位）表明急性二次登革熱感染。如果要區(qū)分是初次還是二次感染，就應(yīng)該用到登革熱Duo ELISA法。

解釋

結(jié)果解釋

推薦一種報(bào)道結(jié)果的方法：由Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法得出下列結(jié)果。不同方法得出的結(jié)果不能互換。測(cè)量結(jié)果超出臨界值不表示現(xiàn)有抗體總量。結(jié)果應(yīng)該報(bào)告為陽性、陰性或可疑，而不能報(bào)數(shù)值。

1．臨床診斷必須根據(jù)臨床癥狀和病人體征來解釋。從試劑得來的結(jié)果不是診斷性的。應(yīng)該結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和病人癥狀來考慮。

2．在不同的地理區(qū)域，人群血清流行病學(xué)可能會(huì)隨著時(shí)間的改變而變化。因此，那臨界值可能需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐难芯窟M(jìn)行調(diào)整。

3．不能用來做一般人群的篩查。陽性預(yù)值依賴于現(xiàn)存在病毒的可能性。只能對(duì)有臨床癥狀的病人進(jìn)行測(cè)試，或者有可疑暴露時(shí)。

4．和黃病毒屬出現(xiàn)血清學(xué)交叉反應(yīng)是常見的事（即在登革熱1，2，3，4型和日本腦炎、墨累山谷腦炎、圣路易腦炎、黃熱病、西尼羅河病毒等之間）。在確診前必須排除這些疾病。在做登革熱IgG捕獲ELISA法的臨床試驗(yàn)中，我們觀察到IgG水平之間也存在交叉反應(yīng)，在其它組也有類似的發(fā)現(xiàn)。

5．免疫測(cè)定中的嗜異染抗體是一種很好識(shí)別的干擾原因。這些動(dòng)物IgG抗體可能會(huì)與試劑IgG抗體交叉反應(yīng)并產(chǎn)生假陽性。這在確診前也必須被排除。

6．沒有為可視的結(jié)果確定建立表現(xiàn)特征。

7．這個(gè)測(cè)定利用昆蟲表達(dá)蛋白。人類抗-昆蟲抗體的交叉反應(yīng)或干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果來說是不可知的。

8．根據(jù)Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法，所有的血清都顯示為一個(gè)陽性結(jié)果時(shí)，這時(shí)應(yīng)該送交參照實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確定和流行病學(xué)記錄。

登革熱二次感染表現(xiàn)為在感染發(fā)作后的1~2天特異性IgG水平很高，而且大多數(shù)病例還伴有IgM水平的升高。

在一些二次感染中，可檢測(cè)到的IgG抗體水平可能是低的。一些病人在感染后的頭7~10天可能不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)到水平的抗體。只要癥狀還存在，我們就建議在*份樣本后的4~7天對(duì)病人重新進(jìn)行測(cè)試。

在馬來群島的一所大學(xué)里，我們用Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法對(duì)血凝抑制和內(nèi)部ELISA法標(biāo)記的146份回顧性血清進(jìn)行了測(cè)試。這些血清包括30份地方性的血清陰性樣本，60份表現(xiàn)為初次登革熱感染陽性的血清樣本和56份表現(xiàn)為二次登革熱感染陽性的樣本。結(jié)果用來測(cè)定該方法的靈敏性，特異性和一致性。數(shù)據(jù)見表1。

表1 Panbio ELISA血清學(xué)靈敏性和特異性與登革熱疾病狀況的比較

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法

＊可疑樣本的重測(cè)試沒有計(jì)算在內(nèi)。

95% CI＊

血清學(xué)靈敏性（二次感染）b =48/56  = 85.7%    73.8 – 93.6%

血清學(xué)特異性（初次感染）b = 56/60  = 93.3%   83.8 – 98.2%

血清學(xué)特異性（血清陰性）  = 30/30  = 100.0%  88.4 – 100.0%

血清學(xué)一致性b             =134/146  = 91.8%  86.1 – 95.7%

a 樣品經(jīng)HAI法（滴度≥2560）檢測(cè)為二次登革熱感染陽性。

b可疑數(shù)不包括可疑樣本的重測(cè)試。（見上＊）

＊CI=可疑區(qū)間

為了測(cè)定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法試劑盒的重現(xiàn)性，我們用3個(gè)批號(hào)的試劑盒在不同的3天對(duì)8份血清每份進(jìn)行了3次測(cè)試。用方差分析對(duì)組內(nèi)、日間、組間和總的精密度進(jìn)行了分析。結(jié)果見表2。

表2 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法精密度測(cè)定（用指數(shù)值＊）

所有的值都是從指數(shù)值計(jì)算得來的

SD=標(biāo)準(zhǔn)差； CV=變異系數(shù)

注意：由于列表原因，標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果保留兩位小數(shù)

＊樣品吸光度除以臨界值得到指數(shù)值。

通過測(cè)試一組66份來自其它確診病人（非登革熱）的樣品來測(cè)定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法的診斷特異性。那樣品來自于患有可能存在交叉反應(yīng)疾病的病人。測(cè)試中的每份樣品的Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法分析都要服從于其疾病診斷。結(jié)果參見表3。

表3 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法-交叉反應(yīng)分析