本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）實(shí)現(xiàn)尤文（尤因）肉瘤細(xì)胞中有絲分裂紡錘體的更多細(xì)節(jié)觀察，從而協(xié)助本研究的進(jìn)行?；罴?xì)胞成像等技術(shù)在了解腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移研究中至關(guān)重要。真核細(xì)胞中的有絲分裂紡錘體由中空的微管組成。它在有絲分裂期間的細(xì)胞內(nèi)重復(fù)染色體分離和分裂細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在尤文肉瘤這一類(lèi)的腫瘤細(xì)胞中，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過(guò)檢查有絲分裂紡錘體的機(jī)能障礙來(lái)得以確認(rèn)。
簡(jiǎn)介
使用熒光顯微鏡可以研究腫瘤形成和進(jìn)展過(guò)程中組織及細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的變化。像活細(xì)胞成像這樣的技術(shù)對(duì)更加深入地了解腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的。
在真核細(xì)胞中，由中空微管組成的有絲分裂紡錘體，有助于構(gòu)建復(fù)制細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，并在有絲分裂過(guò)程中將復(fù)制的染色體從原始細(xì)胞中分離出來(lái)。在尤文肉瘤這一類(lèi)的腫瘤細(xì)胞中，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過(guò)檢查有絲分裂紡錘體的機(jī)能障礙來(lái)得以確認(rèn)[1]。
肉瘤是肌肉或骨骼等結(jié)締組織中形成的一類(lèi)腫瘤。尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤，分別生長(zhǎng)于骨骼和肌肉中，是一種傾向于發(fā)生在骨骼生長(zhǎng)活躍區(qū)域附近的兒科腫瘤。除了手術(shù)和化療之外，電離輻射也被用于治療這類(lèi)腫瘤，但這可能會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)中的骨骼受到y(tǒng)ong久性損傷，包括不對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)停滯、脛骨畸形及骨折概率增加等。骨骼損傷的嚴(yán)重度在很大程度上與骨骼接受的輻射劑量成正比。因此，我們有理由認(rèn)為，選擇性放射致敏腫瘤組織的策略可降低實(shí)現(xiàn)局部控制所需的輻射劑量，并能最大限度降低對(duì)鄰近健康組織造成的間接損傷。
運(yùn)用體外研究和小鼠異種移植模型系統(tǒng)，對(duì)使用mRNA合成抑制劑光神霉素A預(yù)處理，可以通過(guò)改變輻射損傷的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)現(xiàn)選擇性放射致敏EWS：Fli1+腫瘤細(xì)胞的假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證[2]。結(jié)果表明，光神霉素A可以通過(guò)抑制參與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使EWS：Fli1+細(xì)胞在體內(nèi)外顯著放射增敏，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡[2]。
使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤細(xì)胞中有絲分裂紡錘體的更多細(xì)節(jié)，協(xié)助癌癥研究人員獲得更有用的見(jiàn)解。
挑戰(zhàn)
在有絲分裂紡錘體成像中，可對(duì)其實(shí)現(xiàn)快速成像，并獲得清晰的高對(duì)比度3D成像，以清晰展示重要細(xì)節(jié)的解決方案最為實(shí)用。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微成像速度快，檢測(cè)靈敏度高，但不幸的是對(duì)于厚樣本的成像通常會(huì)出現(xiàn)失焦不清晰或模糊的情況，這會(huì)降低對(duì)比度[3]。要闡明有絲分裂的不穩(wěn)定性在癌癥等復(fù)雜疾病中的作用，這需要在同一樣本中進(jìn)行多個(gè)關(guān)聯(lián)生物學(xué)標(biāo)記。
方法
該研究中使用了尤文肉瘤細(xì)胞（SK-ES-1）。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀釋/ Dylight 488偶聯(lián)驢抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀釋/Dylight 550偶聯(lián)驢抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342藍(lán)）進(jìn)行染色。染色后，使用介質(zhì)ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）進(jìn)行蓋玻片封片，并通過(guò)使用63×/1.4 NA（數(shù)值孔徑）的油鏡進(jìn)行THUNDER Imager Tissue成像。圖像采集使用大體積成像解析（LVCC）[3]模式，并生成zui大化投影圖像數(shù)據(jù)。
結(jié)果
在有絲分裂過(guò)程中，α-微管蛋白（綠色）形成有絲分裂紡錘體，染色單體（藍(lán)色）會(huì)附著在有絲分裂紡錘體上，而γ-微管蛋白（紅色）集中定位在分裂細(xì)胞中的紡錘極上。通過(guò)THUNDER技術(shù)可觀察到肉瘤細(xì)胞中有絲分裂紡錘體的更多細(xì)節(jié)。清晰的圖像可以展示清晰的結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)行分割和進(jìn)一步的分析。
圖1：尤文肉瘤細(xì)胞SK-ES-1 α-微管蛋白（綠色）、γ-微管蛋白（紅色）和DNA（藍(lán)色）染色后的最da化投影：原始圖像數(shù)據(jù)（左）和THUNDER LVCC模式成像數(shù)據(jù)（右）。
結(jié) 論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]進(jìn)行尤文肉瘤細(xì)胞中的有絲分裂紡錘體成像時(shí)可顯著增強(qiáng)對(duì)比度。與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)成像相比，其可展示細(xì)胞中有絲分裂紡錘體的更多細(xì)節(jié)。
References：
1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Mu?oz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.
2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
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