癌癥免疫學中的3D多標記成像可更好地表征組織變化和細胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺上進行3D成像的單次、超多標工作流程，用于小鼠腫瘤組織成像。通過優(yōu)化成像設(shè)置和先進的拆分技術(shù)，我們準確地拆分了來自15種標記物的信號，實現(xiàn)了細胞類型和功能狀態(tài)的精確識別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具，有助于深入理解腫瘤微環(huán)境。
在癌癥免疫學研究中，評估組織變化和細胞相互作用對于識別特定細胞類型、評估免疫細胞活化狀態(tài)、監(jiān)測特定蛋白質(zhì)和/或基因標記物的表達以及表征腫瘤微環(huán)境至關(guān)重要。不同樣本之間的參數(shù)變化（例如健康與病變、治療與未治療）通常非常復雜，并且發(fā)生在三維環(huán)境中。
腫瘤細胞與其微環(huán)境的相互作用在很大程度上決定了某種類型癌癥的特征，因此成像策略是研究腫瘤組織的自然選擇。現(xiàn)代成像技術(shù)與多種組學方法的結(jié)合在空間生物學這一新興領(lǐng)域中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。來自基因組學、 蛋白質(zhì)組學和代謝組學的信息，與結(jié)構(gòu)和空間-功能關(guān)系結(jié)合，可以提供其他方法難以獲得的洞見。
上述過程由分子和細胞之間復雜的相互作用驅(qū)動。因此，使用熒光成像研究這些過程的實驗設(shè)計需要能夠區(qū)分和定位大量標記物，由抗體識別并與合適染料結(jié)合的靶抗原。
常見的成像一組標記物的方法（即“面板"）包括每次最多4個標記的依次染色/成像/去染步驟，隨后對圖像進行校準并重新定位樣品。
理論上，通過不斷迭代，可以成像無限數(shù)量的標記物，然而在實際操作中，隨著多標記數(shù)量的提高，這變得更加困難。此外，只有在實驗結(jié)束后，即最后一次染色/成像/去染以及多圖像疊加完成后，才能看到所有標記的結(jié)果。
這一點尤為關(guān)鍵，因為在任何給定時刻只有少量標記物可見。成像策略無法改變，如果出現(xiàn)意外或新的情況，也無法返回感興趣區(qū)域進行進一步探索或更改成像參數(shù)，因為樣品已經(jīng)不再相同。
多圖像疊加增加了實驗的復雜性，因為每輪成像都需要一個共同特征或標記，作為基準，使所有標記能夠虛擬地組合在一起。一個廣泛使用的策略是在每次迭代中用 DAPI染色作為錨點，犧牲一個成像通道來進行核染色。另一個限制在于染色/去染步驟的化學性操作，存在改變抗原和/或樣品物理完整性的風險，從而降低多標記結(jié)果的質(zhì)量。最后，3D信息的重建并非經(jīng)典流程中的操作，由于樣品重定位和循環(huán)染色導致的變形，使得這一步變得極其困難。
單次成像方法提供了強大的優(yōu)勢，可以克服超多標應(yīng)用的一些挑戰(zhàn)。
由于所有多標信息同時獲取，研究人員可以探索和調(diào)整成像策略，保護樣品免受嚴苛的去染處理，并直接在3D中獲得數(shù)據(jù)的結(jié)果，帶來額外維度的信息豐富性。
在此，我們通過對小鼠腫瘤組織進行的單次3D 15標（即15種標記物）實驗展示了這種方法的潛力（圖1a）。
圖1：單次超多標工作流程。a, 3D 15標成像實驗概覽。該樣品（固定的小鼠腫瘤組織）使用單輪標記方法對15種生物標記物進行染色，并在配備SpectraPlex功能的STELLARIS平臺上進行3D圖像采集。內(nèi)置的高級拆分技術(shù)能夠準確地分離每種標記物的信號，從而實現(xiàn)細胞類型和功能狀態(tài)的后續(xù)識別。b, 本研究中使用的15標面板，顯示了標記物（染料-靶標組合）及其染料發(fā)射光譜。
選擇15種標記物使得科研工作者能夠?qū)υ摻M織中的一組免疫細胞、癌癥特征和結(jié)構(gòu)標志物進行功能描述。
樣品準備過程中，將小鼠胰腺導管腺癌細胞（KPC-4662）皮下注射到C57Bl/6小鼠體內(nèi)，并允許其生長3周。然后取出腫瘤，固定并制備厚度為70微米的切片并進行染色。
我們選擇了一組目標，以探討免疫腫瘤微環(huán)境：
T細胞（CD4, CD8）
B細胞（B220）
髓系細胞（包括樹突細胞）
T細胞的功能標記（TCF1, FoxP3, PD1）
此外，實驗還包括了結(jié)構(gòu)性和與癌癥相關(guān)的標記物：
增殖標記（Ki67）
基質(zhì)細胞（α-SMA, MHC I）
上皮細胞（E-鈣黏蛋白, MHC I）
細胞外基質(zhì)（Tenascin C）
內(nèi)皮細胞（CD31）（圖1b）
使用STELLARIS共聚焦顯微鏡進行成像，該顯微鏡配備了名為SpectraPlex的新功能，專門為超多標成像方法提供一組工具。共聚焦功能不僅可以獲取薄組織切片的大視野圖像（如寬場的迭代成像方法），還可以在整個z范圍內(nèi)生成3D 圖像。高分辨率的3D數(shù)據(jù)支持空間分布模式的全面探索。
利用SpectraPlex，該15標實驗的步驟由“標記面板"引導。這些標記物通過在軟件中定義生物目標和染料的組合來實現(xiàn)，并可添加到一個名為“虛擬冰箱"的數(shù)據(jù)庫中。數(shù)據(jù)庫中存儲了實驗室中常用或自創(chuàng)建的標記物。
將相關(guān)的標記物從虛擬冰箱中移動到專用工具中，即可創(chuàng)建面板通過實時計算，面板為顯微鏡采集設(shè)置提供建議。這為儀器的后續(xù)交互操作提供實驗控制的指導，而手動優(yōu)化選項則為經(jīng)驗豐富的用戶提供了靈活性。
在此示例中，基于先前經(jīng)驗和商業(yè)染料設(shè)計確定了特定的目標-染料組合。我們利用了整個激發(fā)光譜范圍 （405nm及440–790nm）和熒光發(fā)射光譜（高達850nm）（圖1b）。
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