分子信標的發(fā)展

分子信標是一種設計巧妙的熒光探針。在長度為15-30mer寡核昔酸探針的兩端分別加上5-8mer序列互補的莖桿區(qū)。在自由狀態(tài)時由于莖桿區(qū)互補序列的結合使探針分子形成發(fā)夾狀結構，所以又被稱為發(fā)夾探針。探針的5'端及3'端分別聯(lián)用熒光素分子及碎滅劑分子。為經典的分子信標結構，其中1-氨基蔡-8-叛酸（EDANS）為熒光素，二甲氨基偶氮苯甲酚（DABSYI.）為猝滅劑。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結構的兩個末端靠近，使熒光分子與碎滅分子靠近（約為7-1Onm）。此時發(fā)生熒光共振能量轉移，使熒光分子發(fā)出的熒光被碎滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎*被猝滅，熒光本底極低。為分子信標的工作原理，當分子信標與序列*互補的靶標分子結合形成雙鏈雜交體時，信標莖桿互補區(qū)被拉開，熒光分子和碎滅分子距離增大。根據Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比。雜交后，信標分子的熒光幾乎100%恢復。且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標的量成正比。

　　分子信標中zui常用的猝滅劑是DABSYL，它對多種熒光素都有較強的熒光猝滅效率。近來Dubertret等用金納米粒子簇代替DABSYL做猝滅劑，人們還可以通過調節(jié)金屬納米簇的形狀、大小和組成而得到不同的猝滅劑。由于金納米簇對熒光試劑有著更高的猝滅效率，所以用金納米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信標的靈敏度和特異性

　　分子信標這一熒光信號傳導機制是基于熒光能量轉移基礎上的?？赡苡袃煞N能量轉移的形式存在：直接的能量轉移和熒光共振能量轉移。當熒光基團和猝滅基團距離很近時，由于兩個基團分子相互碰撞可產生直接的能量轉移。當兩個基團的距離在且能量給體（熒光基團）的發(fā)射光譜與能量受體（猝滅基團）的吸收光譜有較大程度的重疊時，則可發(fā)生熒光共振能量轉移。由于已發(fā)現(xiàn)（二甲基胺基苯基）偶氮苯甲酸可作為分子信標通用的猝滅基團，它對多種發(fā)射光譜不同的熒光基團都有很好的猝滅作用。因此，直接的能量轉移可能是一種主要的熒光能量轉移機制。

　　分子信標zui初被用作聚合酶鏈反應（PCR）的熒光探針，分子信標工作原理，它既可以對擴增產物進行定量檢測，又可以對擴增的過程進行實時的監(jiān)測zui近國內孔德明等設計出了TagMan分子信標，也是一種性能良好的PCR熒光探針。

　　Tyagi等在發(fā)明了傳統(tǒng)的分子信標后，又設計了一種熒光波長轉移型分子信標，即在分子信標的一末端連接兩個不同的熒光基團：熒光收集基團和熒光發(fā)射基團，分子信標的另一末端連接猝滅基團。未結合靶分子時，它與傳統(tǒng)的分子信標一樣，熒光收集基團吸收的能量傳給猝滅基團，以熱的形式放出，不產生熒光；當與靶分子結合發(fā)生構象變化后，熒光收集基團的熒光并未恢復，而是把能量以熒光共振能

　　量轉移的形式轉移給熒光發(fā)射基團，熒光發(fā)射基團將能量以熒光的形式放出。這樣可以通過選擇不同波長的熒光發(fā)射基團，從而使分子信標按設計的要求發(fā)出不同顏色的熒光。同時，這種新型的分子信標具有較大的斯托克位移，解決了傳統(tǒng)分子信標中激發(fā)波長和發(fā)射波長差別較小，從而使一部分激發(fā)光通過反射和散射到達檢測器，影響靈敏度的問題。

　　TagMan分子信標仍然保留了經典分子信標的莖一環(huán)結構，不同的是，TagMan分子信標除環(huán)部序列外，其5'一端莖序列也被設計為探針的基因識別部位。當探針與靶標序列發(fā)生特異互補雜交形成雙鏈時，Taq酶的5'—3'外切活性即被激活，將探針5' 端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使熒光分子與碎滅分子*分開，熒光恢復。TagMan分子信標集中了TagMan探針和分子信標兩種探針技術的優(yōu)點，在雜交和探針降解過程中TagMan分子信標均能產生熒光信號，這使得TagMan探針具有更高的靈敏度。

　　根據分子信標原理，NobukoHamaguchi等人設計了Aptamer信標用于直接檢測蛋白質。他們將抗凝血酶適體（Aptamer）的5'端連上一段ssDNA，使之與適體的3'端部分序列互補，形成莖環(huán)結構。自由狀態(tài)時，熒光分子與碎滅分子靠近，熒光被*碎滅。當凝血酶存在時，適體會折疊成一定的構象，通過三維結構與凝血酶發(fā)生特異性結合。這樣Aptamer信標的莖環(huán)結構被破壞，熒光分子與猝滅分子分開，熒光恢復。通過改變Aptamer信標的組成或莖桿區(qū)的長度，Aptamer信標可以用于不同種蛋白質的測定。與酶聯(lián)免疫吸附測定蛋白質相比，Aptamer信標技術具有簡單、直接、靈敏、省時等優(yōu)點。人們還可以將多種Aptamer信標固定在芯片上，用于單一蛋白質的檢測和分析。Aptamer信標技術的缺點是不能用于檢測非特異性ssDNA結合蛋白，而且信標的構象受金屬離子影響很大，一些金屬離子的存在會干擾熒光信號的觀測，特殊的發(fā)夾結構使分子信標具有很強的特異性識別靶標序列的能力，目前已成為分子生物學和生物技術中一種強有力的研究工具。

　　近年來，分子信標技術得以飛速發(fā)展，已滲透到結構和分子生物學、基因和生物技術等領域的各個方面。毫無疑問的是分子信標技術有著廣闊的應用空間。Chance等人已合成了一種可以診斷乳腺癌的分子信標，這預示著分子信標技術將會給癌癥等疾病的診斷和治療帶來重大突破。可以直接用于檢測非擴增靶標序列的分子信標技術已經出現(xiàn)，并倍受人們的關注，但提高檢測靈敏度仍是這項技術發(fā)展的關鍵，隨著微量檢測技術和光譜技術的發(fā)展以及核酸酶、無機納米粒子用于分子信標結構的設計，各種新型分子信標的出現(xiàn)，使分子信標靈敏度的進一步提高成為了可能。另外，分子信標還會在研究小分子一DNA的相互作用、蛋白質一DNA的相互作以及生物傳感器的研制等領域里繼續(xù)發(fā)揮著自己的優(yōu)勢。