本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠促黃體激素（LH）水平。向預(yù)先包被了大鼠促黃體激素（LH）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入大鼠促黃體激素（LH），溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗LH抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠促黃體激素（LH）的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個	1個
酶標(biāo)包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品: 3600ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
鏈霉親和素-HRP	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
生物素標(biāo)記的抗LH抗體	0.5ml×1瓶	1 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱。

2．標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．蒸餾水，

5．一次性試管

6．吸水紙

注意事項

1．從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差

3．嚴(yán)格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

4．為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

5．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

6．底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標(biāo)本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作程序

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。）

1800ng/L	5號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
900ng/L	4號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
450ng/L	3號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
225ng/L	2號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
112.5ng/L	1號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3. 加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗LH抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；3）代測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗LH抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

7. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

8. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。

9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。

操作程序總結(jié)：