人血清白蛋白(HSA)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中HSA含量。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中同時(shí)加入酶標(biāo)的抗原和待測(cè)抗原，被測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。待測(cè)標(biāo)本濃度越高，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中待測(cè)物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。  

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 
• 標(biāo)準(zhǔn)品：2瓶，每瓶臨用前以0.8 ml樣品稀釋液稀釋，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100 ug/mL，做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后，分別稀釋成100 ug/mL，33.3 ug/mL，11.1 ug/mL，3.7 ug/mL，1.23 ug/mL，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ug/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制33.3 ug/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100 ug/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有1 ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測(cè)溶液A：2×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔50ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
• 檢測(cè)稀釋液A：2×10ml/瓶。
• 底物溶液：1×10ml/瓶。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。
• 覆膜：1×5張

自備物品 

1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說(shuō)明提前預(yù)熱） 

2.   微量加液器及吸頭，EP管

3.   蒸餾水或去離子水，全新濾紙 

標(biāo)本的采集及保存 

• 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 樣本處理： 血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋500-1,000倍。標(biāo)本使用0.1 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

• 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。用離心管稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本，分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50ul，然后立即每孔加檢測(cè)溶液A工作液 50ul，輕輕振動(dòng)，混勻，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
• 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。
• 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘以內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度蘭色，前3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
• 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

注：

1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制：Detection A在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品或檢測(cè)溶液A工作液。

6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7.  底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

    建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

2.  自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人HSA，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 

檢測(cè)范圍：1.23 ug/mL - 100 ug/mL

zui低檢測(cè)限：0.3 ug/mL

說(shuō)明 

• 在儲(chǔ)存及孵育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
• 試劑盒保存：請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A和檢測(cè)溶液B保存于-20℃，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4℃，長(zhǎng)期保存則置于-20℃。
• 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 
• 剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 
• 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
• 有效期：6個(gè)月。
• 本操作說(shuō)明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。