臨床免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的歷史

    *，現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展與微生物學(xué)尤其是細(xì)菌學(xué)是密不可分的，臨床免疫測(cè)定技術(shù)的發(fā)展亦是如此。當(dāng)機(jī)體感染病原微生物時(shí)，要想使臨床醫(yī)師盡早采取適當(dāng)?shù)拇胧┻M(jìn)行治療，人們就希望能盡快盡早地知道機(jī)體所感染的是何種病原體，傳統(tǒng)的病原體感染診斷一般要經(jīng)過(guò)這樣一個(gè)過(guò)程，即首先對(duì)可能存在有病原體的體液或分泌物標(biāo)本進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)后，再通過(guò)分析其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和生物化學(xué)特性，以確定其到底是哪一類及哪一種病原體。這是一種行之有效的方法，直至今天，其仍是病原體感染診斷難以替代的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法診斷病原體感染，不但繁瑣、費(fèi)時(shí)以及效率低，而且并不是的，因?yàn)橛幸恍┎≡w，或采用體外培養(yǎng)方法生長(zhǎng)特別緩慢，或根本就沒(méi)有合適的培養(yǎng)方法，這就使得這一類病原體感染的診斷難以進(jìn)行。比如，沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis）作為一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生病原體，使用體外培養(yǎng)方法檢測(cè)，不但時(shí)間特別長(zhǎng)，而且很容易培養(yǎng)失敗，得到假陰性結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)亦是如此。又如，有些病毒如大家熟知的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等到目前為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)合適的可用于臨床診斷的培養(yǎng)方法。因此，這些難于采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)的病原體感染診斷治療的要求，迫使人們必須去尋找其他的檢測(cè)途徑，直接的或是間接的。此外，即使是可以用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病原體，僅進(jìn)行形態(tài)及生物化學(xué)鑒定，有時(shí)并不足以*準(zhǔn)確地鑒定病原體，仍具有一定程度的盲目性。于是，隨著人們對(duì)病原體感染與機(jī)體免疫應(yīng)答的逐步認(rèn)識(shí)，以抗原抗體特異反應(yīng)為基礎(chǔ)的，更為快速簡(jiǎn)便的免疫檢驗(yàn)方法就應(yīng)運(yùn)而生了?？偟膩?lái)說(shuō)，檢測(cè)病原體感染的免疫檢驗(yàn)方法根據(jù)其檢測(cè)目的物可分為兩類，一類是檢測(cè)病原體抗原而直接反映病原體感染的方法，另一類是檢測(cè)機(jī)體因?qū)Σ≡w的抗體應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體而間接反映病原體感染的方法。

    臨床免疫檢驗(yàn)技術(shù)的出現(xiàn)zui早可追溯至19世紀(jì)末。1896年，Widal發(fā)現(xiàn)在傷寒桿菌中加入傷寒病菌人的血清可致傷寒桿菌發(fā)生特異的凝集現(xiàn)象，利用這種凝集現(xiàn)象可有效的診斷傷寒病，這就是zui早的用于病原體感染診斷的免疫凝集試驗(yàn)，亦即的肥達(dá)試驗(yàn)（Widaltest）。稍后，即1897年，Kraus又發(fā)現(xiàn)將細(xì)菌培養(yǎng)液與其相應(yīng)的抗血清混合后可發(fā)生肉眼可見(jiàn)的沉淀反應(yīng)，于是，免疫沉淀試驗(yàn)又應(yīng)運(yùn)而生。到1900年，維也納大學(xué)病理解剖系的年僅32歲的助教Landsteiner發(fā)現(xiàn)在一些人的血漿能使另一些的紅細(xì)胞凝集，這種同種凝集現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，成為人類血型分類的基礎(chǔ)，并由此而衍生了生物科學(xué)中的一個(gè)特殊分支即免疫血液學(xué)，Land—steiner也因人類血型的發(fā)現(xiàn)獲得了1930年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。并且，直至今天，我們?nèi)匀辉谑褂没镜募t細(xì)胞凝集試驗(yàn)鑒定ABO血型。在同一年代，Bordet又發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（c。mplementfixationtest，CFT），即抗原抗體反應(yīng)后具有補(bǔ)體結(jié)合的能力，如紅細(xì)胞與溶血素反應(yīng)后，如有補(bǔ)體存在即可出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。因此，利用這種免疫溶血機(jī)制做指示系統(tǒng)，可以檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的存在與否。1906年Wassermann將這種試驗(yàn)用于梅毒螺旋體感染的診斷，建立了的華氏反應(yīng)。

    下面我們首先來(lái)看看免疫沉淀反應(yīng)測(cè)定技術(shù)的發(fā)展歷程。1902年Ascoli建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)。1905年Bechhold將抗體混溶在明膠中，然后再將相應(yīng)特異抗原加于其上，抗原抗體的特異結(jié)合可在明膠中出現(xiàn)沉淀。1946年Oudin報(bào)道了試管單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。到1965年Mancini又提出了平板單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，這種試驗(yàn)的出現(xiàn)使得以前只能進(jìn)行定性測(cè)定的免疫試驗(yàn)進(jìn)入到了定量的時(shí)代，并且其仍是目前zui為常用的簡(jiǎn)易抗原定量方法，如免疫球蛋白、補(bǔ)體C3和C4等的測(cè)定。由Ouchterlony首先報(bào)道的平板法雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，仍然是抗原抗體鑒定的zui基本方法之一。由Grabar和Williams在內(nèi)1953年首先報(bào)道的免疫電泳，其將區(qū)帶電泳和免疫雙擴(kuò)散有機(jī)地結(jié)合了起來(lái)，可很方便地用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異體液蛋白的識(shí)別。其后，又出現(xiàn)了對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳和免疫固定電泳（im—munolixationelectrophoresis，IFE）等。免疫沉淀反應(yīng)發(fā)展到此，基本上可以說(shuō)是經(jīng)典免疫沉淀試驗(yàn)發(fā)展階段，這些所謂的經(jīng)典免疫沉淀試驗(yàn)不但測(cè)定范圍狹窄（10～lOOt~g／m1）、靈敏度低，而且繁瑣費(fèi)時(shí)，不能自動(dòng)化，因此，到了20世紀(jì)70年代，根據(jù)抗原抗體能在液相中快速結(jié)合的原理，出現(xiàn)了微量免疫沉淀試驗(yàn)，即免疫透射比濁測(cè)定、免疫膠乳比濁測(cè)定和免疫散射比濁測(cè)定，這幾種比濁測(cè)定方法均已用于臨床體液特定蛋白含量的測(cè)定，現(xiàn)已有多種自動(dòng)化檢測(cè)儀器應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，尤其是免疫散射比濁測(cè)定。

    免疫凝集反應(yīng)測(cè)定技術(shù)則經(jīng)歷了直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)和自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)等幾個(gè)發(fā)展階段。直接凝集試驗(yàn)常用的有玻片法和試管法兩種，如在玻片上進(jìn)行的紅細(xì)胞ABO血型的鑒定試驗(yàn)，在試管中進(jìn)行的肥達(dá)試驗(yàn)和外斐試驗(yàn)（Weil-Felixtest）以及交叉配血凝集試驗(yàn)等。間接凝集試驗(yàn)中曾經(jīng)應(yīng)用較為廣泛的有間接血凝試驗(yàn)和膠乳凝集試驗(yàn)，如國(guó)內(nèi)20世紀(jì)80年代初廣為應(yīng)用于HBsAg測(cè)定的反向間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)，用于hCG和類風(fēng)濕因子（RF）測(cè)定的膠乳凝集試驗(yàn)等。自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)則是近些年來(lái)發(fā)展的不同于以前的免疫凝集試驗(yàn)的快速檢驗(yàn)技術(shù)，其zui大的特點(diǎn)是采用一種雙功能抗體試劑，以患者自身紅細(xì)胞作為凝集反應(yīng)指示系統(tǒng)，檢測(cè)方便快速，只要2min就完成凝集反應(yīng)。

    由上述可見(jiàn)，以免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫檢驗(yàn)技術(shù)，除了免疫比濁外，均無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單方便，有些具體測(cè)定方法，即使是在今天，仍有著廣闊的應(yīng)用空間，有其不可替代的一面，盡管如此，以免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫檢驗(yàn)技術(shù)的局限性還是非常明顯的，如測(cè)定靈敏度低，除少數(shù)外，基本上都是定性測(cè)定等，這些缺陷大大限制了其在病原體感染診斷及體液中微量生物活性物質(zhì)測(cè)定中的應(yīng)用價(jià)值。

    如果我們將免疫沉淀和免疫凝集試驗(yàn)定為經(jīng)典的免疫測(cè)定技術(shù)，那么，標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)就可以說(shuō)是現(xiàn)代免疫測(cè)定技術(shù)，經(jīng)典的免疫測(cè)定技術(shù)所不能解決的臨床測(cè)定問(wèn)題在標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)前均能迎刃而解。在標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)中zui早使用的標(biāo)記物是熒光素。1941年Coons建立的熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）為定位組織和細(xì)胞中的抗原物質(zhì)提供了‘個(gè)直接而又有效的手段。在20世紀(jì)40年代以前，所出現(xiàn)免疫測(cè)定技術(shù)基本上都是定性或半定量測(cè)定方法，到50年代末60年代初，才出現(xiàn)*的定量測(cè)定方法，即放射免疫試驗(yàn)（radioimmnuoassay，RIA）。高靈敏放免測(cè)定技術(shù)的出現(xiàn)，解決了以前難以測(cè)定的微量生物活性物質(zhì)如激素的臨床檢測(cè)問(wèn)題，其之一Yalow因此而獲得了1977年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。盡管放免測(cè)定技術(shù)的出現(xiàn)是免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展*的一個(gè)里程碑，但由于其有試劑半衰期短，實(shí)驗(yàn)廢液難以處理，污染環(huán)境等缺點(diǎn)，使得其現(xiàn)已在逐步退出在臨床常規(guī)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，而采用非放射性核素標(biāo)記物建立標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)成為發(fā)展主流。1966年，美國(guó)的Nakane和Pierce以及法國(guó)的Avrameas和Uriel同時(shí)報(bào)道了酶免疫測(cè)定技術(shù)。其將酶替代熒光素，用于抗原在組織中的定位，可通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡來(lái)觀察。60年代末，在酶免疫組織化學(xué)的基礎(chǔ)上，Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等發(fā)展了一種酶標(biāo)固相免疫測(cè)定技術(shù)，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent as—say，ELISA），這種簡(jiǎn)單方便的免疫測(cè)定技術(shù)出現(xiàn)后，不但成為了一種非常簡(jiǎn)便的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測(cè)，并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)。其后，1972年Rubenstein等又建立了一種無(wú)需分離洗滌步驟的均相（homogeneous）酶免疫測(cè)定技術(shù)——酶放大免疫分析技術(shù)（Enzyme multiplied immunoassay technique，E—MIT），這種測(cè)定技術(shù)主要限于小分子物質(zhì)如藥物等的測(cè)定應(yīng)用。隨著70年代中期雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了單克隆抗體，其應(yīng)用于免疫測(cè)定，極大地提高了免疫測(cè)定的靈敏度和特異性，且為各種免疫測(cè)定方法的設(shè)計(jì)提供了廣闊的想象空間，各種免疫測(cè)定技術(shù)相繼出現(xiàn)，如一步法雙抗體夾心酶免疫測(cè)定，各種均相酶標(biāo)或放射性核素標(biāo)免疫測(cè)定方法等。到了80年代，研究人員又發(fā)現(xiàn)膠體金可以作為抗體的標(biāo)記物，建立簡(jiǎn)便快速的免疫滲濾層析試驗(yàn)，即所謂的金標(biāo)試紙條。進(jìn)入90年代，使用不同測(cè)定原理的各種自動(dòng)化免疫分析儀不斷應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，給我們實(shí)驗(yàn)室的日常工作不但帶來(lái)了很大的便利，而且其測(cè)定較之人工操作更為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。近幾年，基因工程免疫測(cè)定試劑和基因工程抗體的發(fā)展，又一次拓寬了免疫測(cè)定技術(shù)的發(fā)展途徑。

    綜觀免疫測(cè)定技術(shù)100多年的發(fā)展歷程，可以看出，這種建立在抗原抗體特異相互作用基礎(chǔ)上的臨床檢驗(yàn)技術(shù)，已成為我們認(rèn)識(shí)了解生命未知物質(zhì)的一個(gè)難以替代的手段，其發(fā)展的每一步都來(lái)自于相關(guān)學(xué)科研究認(rèn)識(shí)的深入。如果說(shuō)抗原抗體特異相互作用只是免疫測(cè)定技術(shù)的基本框架，那么，標(biāo)記物、單克隆抗體、固相支持物等等就像是這個(gè)框架上zui豐富多彩的外裝。

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