ELISA的基本原理-固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)

一、ELISA的基本原理

    酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顧名思義就是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為

基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。因此，一個(gè)ELISA測定試劑，其有機(jī)組成部分包括三個(gè)方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過程而喪失。整個(gè)測定中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度與臨床標(biāo)本中待測物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來完成測定。

二、固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)

    通常所提到的抗原抗體的相互作用，一般指的是在液相狀態(tài)下，那么在固相狀態(tài)下，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)有什么樣的特點(diǎn)呢?本處作一簡單介紹。

    1．固相上抗原抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間  通常，固相免疫測定如ELISA中抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，要大于液相免疫測定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孑L板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴性，擴(kuò)散性越強(qiáng)則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。這一點(diǎn)可通過旋轉(zhuǎn)振蕩來達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來做到這一點(diǎn)。微顆粒小于lum時(shí)，在測定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆?；蛑檩^大時(shí)，則會(huì)在沒有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測定的擴(kuò)散依賴性。

    2．反應(yīng)體積  此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測定，但比反應(yīng)管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體—固相界面，可能處于一級結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于10nm。液相中待測抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。這也是全自動(dòng)化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積，這無法計(jì)算。這一點(diǎn)使得使用通常的質(zhì)量作用定律圖形的Keq的計(jì)算變得復(fù)雜化，因此，固相抗原抗體反應(yīng)的KeQ值與液相抗原抗體反應(yīng)的Keq值沒有可比性。

    3．離解速率  界面包括細(xì)胞表面上的結(jié)合反應(yīng)的離解速率較液相中的要低兩個(gè)梯度，固相免疫測定中的緩慢的離解速率與細(xì)胞表面上發(fā)生的緩慢的離解速率的相似性很有意思，其原因如下：首先，細(xì)胞表面上的許多的相互作用涉及到細(xì)胞表面受體的聚集，由于多價(jià)復(fù)合物離解的減少，相應(yīng)地親和力增加。研究表明，被動(dòng)吸附于固相的抗原和抗體顯然也是成簇或聚集狀的，因此，反應(yīng)界面的抗原或抗體可能也是“成簇的”。其次，大多數(shù)抗原—抗體的離解所需的能量比防止其結(jié)合所需的能量要大，表明在初始結(jié)合鍵形成后，又形成了次級結(jié)合鍵。這提示在固相免疫測定和其他細(xì)胞表面反應(yīng)中，形成了大量的次級結(jié)合鍵。第三，很高的固相抗體或抗原濃度，尤其是以成簇出現(xiàn)的以及來自于限定的界面反應(yīng)體積的抗體或抗原，使得離解的抗原的重新結(jié)合較液相系統(tǒng)更為快速。這可以解釋為何固相免疫測定與液相測定相比時(shí)，其抗體的Keq較高。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測定技術(shù)具有很好的適用性，即使是測定的反復(fù)洗滌步驟，也不影響受體配體的相互作用，使之保持結(jié)合狀態(tài)。

    4．微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定  使用吸附的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定，

與液相測定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體—配體相互作用的穩(wěn)定性似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因?yàn)椋?/span>

    （1）有結(jié)合能力的抗原濃度極低。這可能是由于所吸附的抗原因?yàn)樽冃曰蚩臻g位阻而致

抗原表位喪失的結(jié)果。

    （2）抗原表位由于吸附發(fā)生改變，使得被其抗體結(jié)合部位以較低的親和力結(jié)合。當(dāng)抗原以l一5ug／m1濃度被動(dòng)吸附于固相時(shí)，大多數(shù)蛋白抗原的60%～80％至少會(huì)以一個(gè)單層而穩(wěn)定的吸附于固相，這樣在固相上的總的抗原就不會(huì)缺乏。如果500～800ng抗原穩(wěn)定的吸附于微孔板孔，對含500／~g／ml抗體的血清的1：10 000稀釋可提供大于10倍過量的抗原，考慮到相互作用的合理的Keq，吸附抗原的有限性不能解釋這個(gè)結(jié)果。因此，由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失，似乎更有可能。

    5．固相的抗體或抗原  固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構(gòu)型不一樣，對抗體或抗原由于固相化尤其是被動(dòng)吸附或其他吸附方式所致的構(gòu)型改變已有充分的認(rèn)識(shí)。

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