人白介素8（IL-8/CXCL8）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用                                    

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中白介素8（IL-8/CXCL8）含量。

概述

白細胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的人單核細胞培養(yǎng)液上清中分離提純的一種堿基肝素結合蛋白，具有內源性白細胞趨化和活化作用，zui初命名為單核細胞源性中性細胞趨化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF），1998年被正式統(tǒng)一命名為中性粒細胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8屬于CXC型亞家族。又因其氨基酸*個半胱氨酸前有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸而稱為ELR⁺-CXC型趨化因子。IL-8是一種可由多細胞來源的多功能趨化因子，其生物學功能無種屬特異性，除具有特異性使中性粒細胞離開血流游走到炎癥組織，脫顆粒，產(chǎn)生超氧陰離子，引起呼吸爆發(fā)外，還顯示出促血管生成的活性，可參與多種惡性腫瘤的轉移及血管生成。此外，IL-8對淋巴細胞和其它免疫細胞也有趨化和活化作用。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IL-8/CXCL8抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗IL-8/CXCL8抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-8/CXCL8呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 pg/ml，將其稀釋為1,000 pg/ml后，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別稀釋1,000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。

如配制500 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）1,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

11.     覆膜：1×5張

標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前*行預實驗以建立*稀釋倍數(shù)。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2.         嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。

3.         洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。

4.         消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

5.         在儲存和溫育時避免強光直接照射。

6.         未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應置于37℃溫育30分鐘；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

7.         建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人白介素8（IL-8/CXCL8），且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3），根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.         洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.         請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4.         如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6.         底物請避光保存。

檢測范圍：15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml

說明

1.          在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。

2.          小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。

3.          試劑盒保存：短期（2周以內）以標簽上的標示為準，長期保存請將試劑全部保存于-20℃。

4.          濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。

6.          中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

7.          所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

8.          有效期：6個月

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