ELISA法檢測(cè)干擾素

    干擾素（IFN）是一類(lèi)具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，僅在同種細(xì)胞上發(fā)揮作用。根據(jù)其來(lái)源、理化及生物學(xué)性質(zhì)的不同，可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種干擾素。其中，IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-β由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-γ主要由T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生。3種干擾素中，IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強(qiáng)，IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)。目前已可用基因重組技術(shù)制備干擾素投入臨床使用。干擾素不能直接滅活病毒，其抗病毒作用是由于它能激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因，制造抗病毒蛋白，抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制。干擾素不僅可抑制已感染細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制，而且還可使未感染細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)，對(duì)中斷病毒的細(xì)胞間傳播有一定作用；但對(duì)病毒整合基因可能僅有暫時(shí)抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細(xì)胞活化因子（macro-phageactivating factor，MAF），活化的巨噬細(xì)胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細(xì)胞。干擾素能增強(qiáng)各種細(xì)胞表達(dá)MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷；還能促進(jìn)T、B細(xì)胞的分化，活化NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，從而有助于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。由于干擾素不是一種淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，故常抑制淋巴細(xì)胞（特別是B細(xì)胞）的增殖。

    IFN抗病毒活性的特點(diǎn)如下：①僅僅是抑制作用，IFN消失后病毒將重新復(fù)制，因此必須足量反復(fù)應(yīng)用；②有相對(duì)的種屬特異性，IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴(yán)格；③IFN不直接滅活病毒，而是通過(guò)細(xì)胞基因組產(chǎn)生另一些蛋白因子來(lái)發(fā)揮效能，因此不同細(xì)胞對(duì)IFN的敏感性不同；④不同感染狀態(tài)的病毒-細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)IFN的敏感性不同，病毒大量復(fù)制、引起細(xì)胞炎癥應(yīng)答時(shí)，IFN易產(chǎn)生效應(yīng)；對(duì)完整細(xì)胞中的整合型病毒無(wú)作用。

    [檢測(cè)方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  抗人IFN抗體包被在微孔反應(yīng)板上，待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IFN會(huì)與抗人IFN抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，同時(shí)加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合，抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IFN，HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃色。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度，IFN濃度與吸光度成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IFN濃度。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  靜脈血2ml，不抗凝。

    [試劑）

    1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板

    2．濃縮酶結(jié)合物

    3．酶結(jié)合物稀釋液

    4．標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液

    5．濃縮生物素化抗體

    6．TFN標(biāo)準(zhǔn)品

    7．濃縮洗滌液

    8.顯色劑A、B

    9．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

    [檢測(cè)步驟]

    1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul，再加生物素化抗體工作液50ul。

    2．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育120min。

    3．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    4．除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100u1。   

    5．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育30min。

    6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色10min。

    8．加入終止液50gl后，輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀（450nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，求出IFN值。

    [正常參考值]  各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值。

    [注意事項(xiàng)]

    1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，來(lái)用完的微孔條用自封袋密封保存。

    2．酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時(shí)間。

    3。滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。

    4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時(shí)應(yīng)注意安全

    5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    6.檢測(cè)劑工作液按說(shuō)明書(shū)臨用前配置。

    7.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)。

[臨床意義]  IFN水平的改變主要見(jiàn)于自身免疫性疾病；在感染性疾病中，升高見(jiàn)于急性病毒感染，降低見(jiàn)于乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。

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