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solarbio質(zhì)粒提取試劑盒簡介說明

閱讀：8913 發(fā)布時間：2010-10-24

質(zhì)粒提取試劑盒簡介

質(zhì)粒（Plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。

質(zhì)粒提取原理及流程

較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）。

堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋自質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。

目前，市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)?？梢杂糜诿盖?、PCR、測序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實驗。

影響質(zhì)粒提取的因素

質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。

宿主菌種類

質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會在裂解時產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。另外，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性，會降低DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA。

培養(yǎng)時間

從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中（含有相關(guān)抗生素的液體培養(yǎng)基中），振蕩培養(yǎng)12-16小時。不應(yīng)超過16小時，因為這時細(xì)胞開始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也會導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。

質(zhì)粒擴增

氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。因此，在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為170ug/ml 。

抗生素

在菌株的各生長階段都應(yīng)加入抗生素篩選?，F(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不含有在細(xì)胞分裂時確保平均分配的par位點，無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。

幾種常用抗生素的濃度

抗生素	儲存濃度	保存條件	嚴(yán)緊型質(zhì)粒工作濃度	松弛型質(zhì)粒工作濃度
氨芐青霉素	50mg/ml（溶于水）	-20℃	20ug/ml	100ug/ml
羧芐青霉素	50mg/ml（溶于水）	-20℃	20ug/ml	100ug/ml
氯霉素	34mg/ml（溶于無水乙醇）	-20℃	34ug/ml	170ug/ml
卡那霉素	10mg/ml（溶于水）	-20℃	10ug/ml	50ug/ml
鏈霉素	10mg/ml（溶于水）	-20℃	10ug/ml	50ug/ml
四環(huán)素	5mg/ml（溶于無水乙醇）	-20℃	10ug/ml	50ug/ml

質(zhì)?？截悢?shù)

質(zhì)?？截悢?shù)常用的定義是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。每個細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的起始復(fù)制機制。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1-2個質(zhì)粒，如F因子；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒，如ColEl質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型，分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。

部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)

質(zhì)粒種類	拷貝數(shù)	起始復(fù)制子	類型
pUC18/19載體	500-700	pMB1	高拷貝
pBluescript載體	300-500	ColE1	高拷貝
pGEM-T載體	300-400	pMB1	高拷貝
pTZ載體	>1000	pMB1	高拷貝
pBR322載體	15-20	pMB1	低拷貝
pACYC及其衍生載體	10-122	p1	低拷貝
pSC101及其衍生載體	5	pSC101	低拷貝

菌液收集及裂解

細(xì)菌收集可以通過離心來進行，不同的質(zhì)?？截悢?shù)，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。菌液是在堿性環(huán)境下裂解的，由于不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄的差異，細(xì)胞的破壁程度不同，對于細(xì)胞壁較厚的宿主菌，首先要進行破壁處理：

革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時就能有效破壁

革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理

酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠

菌液收集、重懸以及宿主菌細(xì)胞破壁后，細(xì)胞在含有RNase A的NaOH/SDS（溶液P2）中裂解。SDS溶解細(xì)胞膜的磷脂和蛋白成分，使細(xì)胞的內(nèi)容物如染色體、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的裂解時間是質(zhì)粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時間，盡量縮短質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中。長時間處在堿性環(huán)境中會導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生不可恢復(fù)的變性。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快，而且不能被限制性內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液P3中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境，高鹽使得變性的蛋白、染色體DNA、細(xì)胞碎片和SDS都沉淀下來，而質(zhì)粒復(fù)性留在上清溶液中。溶液要*、混勻以確保沉淀*。為了防止染色體DNA污染質(zhì)粒DNA，要避免劇烈振蕩，以防止染色體DNA被打斷，造成對質(zhì)粒DNA的污染。因為染色體DNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件下，都可以與硅膠膜結(jié)合，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗脫下來。因此，在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。

質(zhì)粒DNA分離和純化

純化要求

質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對后續(xù)實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。

不同的后續(xù)實驗對于質(zhì)粒純度的要求不同，常規(guī)的分子生物學(xué)實驗（如酶切、測序等）普通純度的質(zhì)粒即可滿足實驗，而對于轉(zhuǎn)染實驗，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無內(nèi)毒素）。可以選擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。

純化方法

用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質(zhì)粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。

質(zhì)粒DNA的洗脫和收集

參見基因組DNA提取

質(zhì)粒的保存

溶解在洗脫液EB中的質(zhì)粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶解的質(zhì)粒只能短期保存，因為實驗室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在酸性環(huán)境下會發(fā)生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保存，也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保存

質(zhì)粒鑒定與評價

瓊脂糖電泳檢測

堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現(xiàn)超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制*的兩個質(zhì)粘連在—起）。如果加溶液P2后過度振蕩，會在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候提取的質(zhì)粒會出現(xiàn)4個以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定后，只有單一條帶，就證明沒有基因組的污染。

酶切檢測

質(zhì)粒提取后，為了進—步鑒定質(zhì)粒的正確與否，就要進行酶切鑒定，通過與Marker對比，確定質(zhì)粒的分子量大小。

用紫外線分光光度計檢測

濃度測定標(biāo)準(zhǔn)為：OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子濃度會影響光吸收值，但并不表示純度低。

質(zhì)粒小量提取試劑盒

目錄號	包裝	價格	產(chǎn)地
D1100-50	50次	元	Solarbio
D1100-100	100次	160元	Solarbio

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，通過吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的特性提取質(zhì)粒DNA。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機化合物。從1-5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取5-15μg純凈地高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85-90％。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)試驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

產(chǎn)品包裝：

試劑盒組成	D1100-50	D1100-100	儲存條件
RNase A	150ul	300ul	-20℃
溶液Ⅰ	15ml	30ml	RT
溶液Ⅱ	15ml	30ml	RT
溶液Ⅲ	20ml	40ml	RT
漂洗液	15ml	15ml×2	RT
洗脫液	10ml	20ml	RT
吸附柱	50個	100個	RT
收集管	50個	100個	RT
說明書	1份	1份	RT

注意事項：

1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。

2、*次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液（如向15ml的漂洗液中加入60ml的無水乙醇）。

3、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心。

5、如果是提取革蘭氏陽性菌質(zhì)粒，必須在裂解細(xì)胞前破細(xì)胞壁，方法如下：收集適量菌體，加入250ul溶液Ⅰ，充分懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度為10-20mg/ml，37℃處理30min左右。加入溶菌酶的濃度和處理時間可根據(jù)不同的菌株和具體試驗條件進行調(diào)整。

6、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右（可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍），pH值低于7.0會降低洗脫效率。

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