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非變性組織/細(xì)胞裂解緩沖液內(nèi)含非離子型去垢劑，能裂解細(xì)胞并在非變性條件下釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。非變性條件下的裂解蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗體結(jié)合或酶學(xué)活性，因此適宜于進(jìn)行免疫共沉淀。另外，有些抗體對(duì)非變性蛋白具有更高的結(jié)合能力或只能識(shí)別非變性蛋白的抗原位點(diǎn)，這種情況應(yīng)該使用非變性裂解。

使用說(shuō)明

根據(jù)使用量，取每 1ml 裂解液加入 10ul PMSF，使 PMSF 的最終濃度為 1mM?；靹騻溆茫≒MSF 現(xiàn)用現(xiàn)加）。

1、樣品前處理：

a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔加入 150-250ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上放置裂解 5-10 分鐘。

b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液，冰上放置裂解 5-10 分鐘。期間可以用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50-100 萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。

c)對(duì)于組織樣品剪成切成細(xì)小的碎片。按照每 20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量)  。  用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

2、后處理：

充分裂解后，將裂解后的樣品 10000-14000g 離心3-5 分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western 和免疫沉淀、免疫共沉淀等操作。

注意事項(xiàng)：

為取得最佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或 4℃進(jìn)行。裂解時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化處理。

非變性蛋白裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的 Triton X-100 等干擾物質(zhì)，不能用 Bradford 法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。