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[器材和試劑]

●電感受態(tài)大腸桿菌TG1（

●37℃孵育箱（NewBrunswick）

●電轉(zhuǎn)化儀及0．2cm間距小杯（GenePulser^TM Biorad）

●16℃水浴

●SOC培養(yǎng)基（將20g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、5g酵母提取物及0．5g NaCl溶于950ml水中。加入10m1 250mmol/L

KCl，5mol/L NaOH調(diào)整pH至7．0并加入去離子水至IL。高壓滅菌。手感變涼后，再加入5ml 2mol/L MgCl₂

和20ml lmol/L葡萄糖）

●100mm和150mm含100ug/m1氨芐青霉素和2%葡萄糖的TYE平板（TYE/amp/glu）（將16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂加入到去離子水中并調(diào)整體積至IL。高壓滅菌。當(dāng)溶液乎感變涼時(shí)，加入氨芐青霉素和葡萄糖并倒板）

●含100ug/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu）

●50%甘油

 

[方法]

1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。

2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。

3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。

4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。

5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電?。?。啟動(dòng)脈沖，立即加入1．0ml SOC培養(yǎng)基并混合。時(shí)間恒定值應(yīng)在4．5～5．5毫秒范圍之間。如果時(shí)間恒定值小于4．3秒，則重復(fù)DNA沉淀。

6．在每次電轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌中加入lmlSOC培養(yǎng)基，以250r/min振蕩培養(yǎng)，37℃1小時(shí)。

7．合并所有電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液，系列稀釋后在100mm TYE/amp/glu平板上鋪板確定文庫容量。

8．以200g、4℃10分鐘離心剩余的細(xì)菌培養(yǎng)液。將每4次電轉(zhuǎn)化的沉淀重懸于500u1的體積。以每份125ul等量體積分別鋪于150mmTYE/amp/glu平板上或?qū)?00ul鋪于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm²。將這些平板在30℃下培養(yǎng)過夜。

9．加入10m1含15%甘油（0．2gm濾膜過濾除菌）的TYE/amp/glu培養(yǎng)基；刮取平板上的細(xì)菌。在-70℃下儲(chǔ)存抗體文庫