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          技術文章

          甲胎蛋白時間分辨熒光免疫分析

          閱讀:717          發(fā)布時間:2010-12-7

          近年發(fā)展的時間分辨熒光測量技術以稀土離子為示蹤材料,具有測量靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無放射性污染和應用范圍廣等優(yōu)點。我們采用時間分辨熒光測量技術,建立了AFP時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)。

            一、材料與方法

            1. 材料與試劑:抗AFP單克隆抗體A137和A47由無錫市第二制藥廠提供。Eu3+標記盒、Eu3+發(fā)光增強液、AFP TRFIA藥盒和AFP參考標準,EG-G-Wallac產品。CA199、CA125和CA153參考標準,CIBACORNING產品。AFP質量控制血清(L:21~35μg/L;M:62~93μg/L;H:173.4~260.2μg/L),中國藥品生物制品鑒定所產品。全自動TRFIA檢測儀(Auto DELFIA 1235)為EG-G-Wallac產品。

            2. 固相抗體制備:將A47單抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3

            pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl,4℃放置過夜。BSA封閉后真空抽干,板條密封后置-20℃冷凍保存。

            3. Eu3+-A137制備:參照Eu3+標記盒說明書操作。取溶解于0.155mol/L

            NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH8.5緩沖液A137(2g/L)500μl加入含0.2mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)凍干粉的小瓶中,30℃磁力攪拌反應20h。反應液經用80mmol/L

            Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰。

            4. 測定方法:采用平衡法建立AFP-TRFIA,即在包被有A47的96孔微孔板上,每孔依次加入25μl AFP參考標準或待測血清,200μl以反應緩沖液1:1000稀釋的Eu3+-A137,25℃振蕩孵育1h后,用洗滌液洗滌6次。再加增強液200μl,25℃振蕩反應5min,熒光檢測。全部過程均在Auto

            DELFIA 1235上自動完成,軟件設置由本所自編。

            5. 數據分析和統(tǒng)計處理:AFP-TRFIA標準曲線由Auto DEFIA 1235自帶的Log-Logit函數處理。精密度圖和可測范圍分析用吳德福IRMA數據處理軟件。統(tǒng)計學處理用t 檢驗。

            二、結果

            1.Eu3+-A137的理化和免疫學鑒定:Eu3+-A137以EG-G-Wallac提供的Eu3+標準為參考,平均每個A137 IgG上連接了7.52個Eu3+,產率達53.07%。選擇AFP參考標準高點(1000μg/L),Eu3+-A137 1:1000稀釋,進行TRFIA,Bmax/T為6.65%,與低點(1μg/L)的發(fā)光計數差達2個數量級以上。被測物和反應發(fā)光計數基本成算術級數正比關系。

            2.AFP-TRFIA的考核:經Log-Logit函數處理程序處理得AFP-TRFIA標準曲線。(1)方法的特異性:將CEA、CA199、CA125和CA153分別配成10~500U/ml、15.8~409U/ml、12.1~732U/ml和27.7~243U/ml一系列不同濃度,代替標準曲線中的AFP參考標準。在上述濃度范圍內,CEA、CA199、CA125和CA153對AFP-TRFIA均無交叉反應。(2)精密度和回收率:本方法的批內和批間CV分別為1.59%和7.14%,8批標準曲線的ABCV均小于0.0114,精密度圖顯示可測范圍為4.22~1210μg/L,回收率為103.98%。(3)靈敏度和穩(wěn)定性:以零劑量點發(fā)光值均值加2s后的發(fā)光值在標準曲線上得到的相應值為0.43μg/L。8條不同時間進行的AFP-TRFIA的效點均值ED20、ED50和ED80分別為(4.25±0.21)μg/L、(35.59±0.19)μg/L和(246.90±0.96)μg/L。

            三、討論

            TRFIA測量儀已進入第三代,分析技術已實現高度自動化。我們所建方法適于測量血清AFP的含量,Eu3+-A137經標準曲線比較鑒定,免疫反應性基本無損失;其凍干品-30℃保存13個月后免疫反應參數基本未改變。用國家的AFP質控血清作樣品進行分析,L、M和H分別為28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L,符合質控要求。我們曾把高含量的AFP血清樣品經1:10~1000稀釋后用于本方法的測定,換算后的AFP含量非常接近;用該系列稀釋血清代替AFP參考標準作標準曲線,其斜率與AFP的標準曲線斜率基本一致,表明AFP-TRFIA有良好的健全性,血清基質對本方法沒有明顯影響。8孔重復4組參考標準點的ABCV均<0.06,批內及批間重復性研究亦證明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技術每次分析,即使單樣品檢測也必須做標準曲線作相對測量的依據。我們建立的AFP-TRFIA同批試劑連續(xù)5個月應用分析,發(fā)現標準曲線基本重合,無明顯漂移,可以用同批試劑單次標準曲線為今后分析的固定參考。這既可減輕臨床應用的工作強度,又可提高藥盒的經濟價值。

            AFP-TRFIA受檢血清用量僅為RIA或IRMA的四分之一,有利于減少樣品對分析系統(tǒng)的干擾,也有助于節(jié)約樣品,便于多指標分析。AFP-TRFIA的分析時間僅為1h,且分析系統(tǒng)高度自動化,這樣可提高臨床檢驗結果的速度,又可大幅度降低為誤差和增加檢出結果的可靠性。

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