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Random priming
閱讀：979 發(fā)布時間：2010-12-18DNA聚合酶要進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)時一定要有引子 （primer），因為它只能以引子所提供的3’-OH為起始點(diǎn)進(jìn)行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。 一般實驗常以人工合成的寡核苷酸為引子進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，這時固然可以根據(jù)已知序列設(shè)計核酸引子，但也可以采用逢機(jī)引子（random primers）。 所謂逢機(jī)引子即其序列為逢機(jī)序列，不經(jīng)特別設(shè)計，目前應(yīng)用zui廣者是以自動化機(jī)器所合成的、六到八個核苷酸長的寡核苷酸混合物；反應(yīng)進(jìn)行中若有任何一條逢機(jī)引子結(jié)合到模版DNA，即可引導(dǎo)DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)行。 以random priming方法進(jìn)行核酸標(biāo)定，是以逢機(jī)引子引導(dǎo)Klenow fragment（large fragment of E. coli DNA polymerase I） 進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，并在反應(yīng)過程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等標(biāo)定物質(zhì)。 而為了避免random priming也發(fā)生于載體部份的DNA，不要直接以質(zhì)體DNA為模版進(jìn)行標(biāo)定反應(yīng)，而應(yīng)預(yù)先將目標(biāo)DNA自載體切除出來。
儀器用具：微量離心機(jī)；沸水浴及冰浴
藥品試劑：
模版DNA （pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段，將由助教提供）
0.2 M EDTA, pH 8.0
4 M LiCl
Random priming kit （Roche）：
Hexanucleotide mix （random primer）
dNTP mixture （1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
mM DIG-11-dUTP, pH 7.5）
Klenow enzyme （2 U/μL）
酒精
70%酒精
TE （10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA）
方法步驟：
◆ 以下反應(yīng)條件與步驟主要參照random priming kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說明書。
1） 取100 ng 模版DNA，加入適量去離子水，把體積補(bǔ)足為15 μL。
2） 于沸水中加熱10 min。
◆ 請記得以夾子固定微量離心管的管蓋部份，以免離心管在加熱過程中蓋子爆開、進(jìn)水！
3） 加熱后，迅速把微量離心管移至冰浴中，靜置數(shù)分鐘。
4） 離心數(shù)秒后，依序加入下列三種試劑：
2 μL hexanucleotide mix
2 μL dNTP mixture
1 μL Klenow enzyme
5） 以指頭輕彈離心管，以便混合均勻。
6） 短暫離心后，置于37℃恒溫水槽中作用2 h。
◆ 反應(yīng)時間至少須要1 h，zui長可反應(yīng)過夜。
7） 作用完畢的后，加入2 μL 的0.2 M EDTA，以便終止DNA 聚合反應(yīng)。
8） 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL純酒精，混合均勻，置 -20℃過夜。
隔天：
1） 于13,000 rpm，4℃離心15 min。
2） 倒出上清液，加入50 μL 的70%酒精，再離心5 min。
3） 倒出上清液并風(fēng)干DNA。
4） zui后以50 μL TE 溶解DNA。