化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA測定的常用模式--間接法測抗體
閱讀：1613 發(fā)布時間：2011-11-29 基本方法的操作如下:
1．將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2．加入含待測抗體的臨床樣本如血清等，溫育一定時間后洗板；此時，待測抗體就會與固陽上特異抗原反應(yīng)而吸附于固相上。
3．加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育一定時間后洗板；此時，在固相上即形成固相抗原—待測抗體—酶標(biāo)二抗復(fù)合物。
4．加入酶底物，溫育顯色測定（圖2—6）。
間接法測抗體在目前應(yīng)用zui多的是丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）、人免疫缺陷病毒抗體（抗HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測定。從上述的測定模式可見，間接法測抗體，嚴(yán)格地講，所測定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標(biāo)二抗體所決定的。
影響間接法測定抗體的一個較大的因素是包被抗原的純度。現(xiàn)在間接法測抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5，TpNl7，TpN47等?；蚬こ炭乖诩兓瘯r應(yīng)盡量去除用來表達的宿主如大腸桿菌的抗原，以免由于機體存在對這種宿主抗原的抗體而引起假陽性反應(yīng)。此外，由于機體的IgG類抗體濃度較高，其中絕大部分為機體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對固相的吸附所致的假陽性反應(yīng)，通常需對待測樣本做一定程度的稀釋。