化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定CIC法
閱讀：596 發(fā)布時(shí)間：2012-2-4細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定法是根據(jù)CIC可與某些細(xì)胞表面的Fc受體或補(bǔ)體受體結(jié)合而建立的細(xì)胞技術(shù)，這類方法有靈敏度較高，特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但需進(jìn)行活細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞分離，影響因素多，重復(fù)性較差，目前僅適用于實(shí)驗(yàn)研究。此類技術(shù)有多種方法。
Raji細(xì)胞是從Burkitt淋巴瘤患者分離建株的B淋巴細(xì)胞系。可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞表面沒(méi)有膜免疫球蛋白，Pc受體的親和力很低，但有C3、C3b和C3d受體及Clq受體，而且不易脫落。因此能使結(jié)合補(bǔ)體的IC吸附在細(xì)胞上，然后再于反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光素或i125標(biāo)記的抗人IgG抗體，使其與結(jié)合在Raji細(xì)胞上的IC中的IRC反應(yīng)，計(jì)算Rail細(xì)胞上結(jié)合的IC中滲入的核素量，即可判定IC的存在與含量。
(一)試劑
1．Raji細(xì)胞懸液 將Raji細(xì)胞培養(yǎng)在含20％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中2—3d后即可收集應(yīng)用，該細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不貼壁、不結(jié)團(tuán)，生長(zhǎng)容易(一般3d即可傳一代)，培養(yǎng)條件不苛求。但pH值應(yīng)在6．5左右，超過(guò)pH7．0則生長(zhǎng)不良。收集細(xì)胞時(shí)要計(jì)數(shù)和檢查活細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)要求活細(xì)胞在95％以上。
2．核素標(biāo)記抗IgC抗體 將兔抗人IgC血清經(jīng)DE52分離兔IsC，用PBS稀釋成蛋白質(zhì)1mg／mL，按每ug蛋白質(zhì)結(jié)合0．3uCi125I標(biāo)記抗人IgC抗體。
(二)操作步驟
1．取培養(yǎng)72h的Raji細(xì)胞1 800r／rain離心10rain，棄去上清液，細(xì)胞沉淀中加入不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，洗2次。
2．計(jì)數(shù)Raji細(xì)胞數(shù)，用*1640培養(yǎng)液配成107／mL細(xì)胞懸液。
3．取1滴細(xì)胞懸液加等量0．1％臺(tái)盼藍(lán)，放37℃10rain，鏡檢著色細(xì)胞不應(yīng)超過(guò)5％。
4．在試管中加入細(xì)胞懸液501~L，再加入1：4稀釋的受檢血清25uL。
5．搖勻后放37~(2 45rain，每5-10rain輕搖一次，使其充分作用。
6．用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌3次，1 000r／min離心5min，棄去上清液。
7．在細(xì)胞沉淀物中加125I標(biāo)記的抗人TgG抗體，用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培養(yǎng)液將標(biāo)記物稀釋成7-10ug／mL。加入標(biāo)記物后置4℃30min，每間隔5—10min輕搖1次。
8．用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培養(yǎng)液洗滌3次，每次1 800r／rain離心10min。
9．取細(xì)胞沉積物用Y計(jì)數(shù)器測(cè)cpm值。
10．用熱變性IgG40ug溶于50uL新鮮混合人血清中，然后倍比稀釋成10個(gè)稀釋度，按上述方法操作測(cè)定cpm。
(三)結(jié)果判斷
以熱聚合IgC的含量為橫坐標(biāo)，cpm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)參考曲線。自參考曲線查出IC中IgC的ug數(shù)，按ug/mL報(bào)告。
(四)注意事項(xiàng)
1．Raji細(xì)胞有時(shí)也帶有Pc受體和表面膜免疫球蛋白，為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映真實(shí)情況，應(yīng)預(yù)試條件，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中加陰性對(duì)照。
2．用熱變性IsC作對(duì)照和參考時(shí)，一定要用新鮮血清作稀釋劑，以補(bǔ)充補(bǔ)體。
除此以外，細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定方法中的血小板凝集試驗(yàn)亦用于實(shí)驗(yàn)研究。其原理是免疫復(fù)合物與血小板相互作用后引起血小板表面發(fā)生改變，導(dǎo)致血小板凝集(有人認(rèn)為血小板凝集與其表面Fc受體活化有關(guān))。試驗(yàn)中必須采用新鮮分離的有活力的血小板，因?yàn)樵贗C存在時(shí)，血小板表面的改變有賴于其代謝狀態(tài)。除IC外，高濃度的游離免疫球蛋白與血小板表面抗原反應(yīng)的抗體和其他物質(zhì)，如荷電分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集；Clq、IgM、RF能抑制IC引起的血小板聚集；待檢血清于試驗(yàn)前加熱滅活，會(huì)使其血小板凝集滴度升高或降低。