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          技術(shù)文章

          大鼠IL-7 ELISA KiT

          閱讀:1149          發(fā)布時(shí)間:2010-1-19

          產(chǎn)品編號(hào): EIA05365
          使用前*閱讀說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理,能測(cè)量大鼠IL-7,只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

          工作原理
          白細(xì)胞介素7是一種促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞生長(zhǎng)的分子。,它主要由是一種促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞生長(zhǎng)的分子等產(chǎn)生。分子質(zhì)量:20-28(kDa), 主要生物學(xué)活性:刺激B細(xì)胞前體、前B細(xì)胞的增殖;促進(jìn)前T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞增殖;誘導(dǎo)CTL和LAK活性。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(ELISA)。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測(cè)相抗體也為多克隆抗體,經(jīng)生物素(biotin)標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān)。

          每套試劑盒中內(nèi)容(96T)
          材料 數(shù)量
          標(biāo)準(zhǔn)品 96T(2vial)
          預(yù)包被抗體的96孔板 96T(8×12)
          生物素標(biāo)記抗體 96T (1:100)
          ABC(親和素-過氧化物酶復(fù)合物) 96T (1:100)
          樣品稀釋液 96T×2
          抗體稀釋液 96T×1
          ABC稀釋液 96T×1
          TMB顯色液A 96T×1
          TMB顯色液B 96T×1
          TMB終止液 96T×1
          ELISA洗滌液 96T×1(1:25)

          需要而未提供的試劑和器材
          1. 37℃恒溫箱。
          2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
          3. 自動(dòng)洗板機(jī)。
          4. 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
          5. 蒸餾水,容量瓶等
          6. 干凈的試管和Eppendof管。

          注意事項(xiàng)
          1. 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
          2. 配制各種試劑時(shí),切記混勻!
          3. 用戶在初次使用試劑盒時(shí),應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
          4. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè)。
          5. 要嚴(yán)格避免操作過程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活!
          6. 為免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。

          洗板方法
          手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
          自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

          樣品的準(zhǔn)備和保存
          樣品如果不立即分析,應(yīng)分裝后冷凍保存,且避免反復(fù)凍融。
          血清——用干凈試管收集血液,室溫凝固2小時(shí)或4℃過夜,離心1000×g 10分鐘,收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
          細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀,立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

          樣品稀釋的一般原則
          用戶須查閱文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量,決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測(cè)范圍。樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。

          試劑的準(zhǔn)備和保存
          A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用:在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液,*溶解后做倍比稀釋。
          稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時(shí)內(nèi)使用。

          B.生物素標(biāo)記抗體工作液:在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
          1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量(實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml)。
          2. 按10ul生物素標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

          C.親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)工作液的準(zhǔn)備:在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
          1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量(實(shí)配時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml)。
          2. 按10ul親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

          D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備:在使用之前30分鐘,按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

          操作程序
          1. 確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
          2. 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為對(duì)照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
          3. 酶標(biāo)板加上蓋,37℃反應(yīng)90分鐘。
          4. 反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體;或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,再對(duì)著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
          5. 將準(zhǔn)備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
          6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右。
          7. 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
          8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,每次浸泡1-2分鐘左右。
          9. 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液,37℃避光反應(yīng),反應(yīng)過程中,要經(jīng)常的觀察,當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3-4孔差別不明顯時(shí),即可加入TMB終止液0.1ml/孔。(顯色反應(yīng)zui長(zhǎng)不要超過30分鐘)。
          10. 用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值。
          11. 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。

          操作程序總結(jié):
          準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

          加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)90分鐘

          洗板2次,加入生物素化抗體工作液,37℃反應(yīng)60分鐘

          洗板3次,加入ABC工作液,37℃反應(yīng)30分鐘

          洗板5次,加入TMB顯色液,37℃反應(yīng)

          加入TMB終止液

          30分鐘之內(nèi)讀OD值

          計(jì)算標(biāo)本待測(cè)因子含量


          檢測(cè)范圍:2000pg/ml→31.2pg/ml。
          敏感性: <2pg/ml
          特異性: 系統(tǒng)和其它細(xì)胞因子無交叉反應(yīng)。
          保存: -20℃ [短期內(nèi)(如兩周)可4℃]
          有效期: 12個(gè)月(-20℃)。
          用途: 用于體外定量分析液體標(biāo)本(通用型)。

          References:
          1. Reiter, Z. and B. Rappaport (1993) Crit. Rev. Immunol. 13:1.
          2. Brunda, M.J. (1994) J. Leukocytye Biol. 55:280.
          3. Wolf, S.F. et al. (1994) Stem Cells 12:154.
          4. Ling, P. et al. (1993) J. Immunol. 150:207A (Abstr.).
          5. Chizzonite, R. et al. (1992) J. Immunol. 148:3117.
          6. Desai, B.B. et al. (1992) J. Immunol. 148:3125.
          7. D’Andrea, A. et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1387.
          8. Chan, S.H. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:869.
          9. Scott, P. (1993) Science 260:496.
          10. Hseih, C-S. et al. (1993) Science 260:547.
           

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