化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
病毒變異的研究方法（二）
閱讀：1439 發(fā)布時(shí)間：2010-3-53.研究方法 研究病毒的遺傳變異，包括幾方面的內(nèi)容：從整體水平上研究病毒的突變率，即某病毒基因組一次復(fù)制過程中某一核苷酸位點(diǎn)因置換、缺失或插入而改變的可能性；根據(jù)某一遺傳學(xué)指標(biāo)（見上述），從自然流行毒株中篩選或結(jié)合應(yīng)用誘變因素篩選有意義的變異株；分析變異株突變的性質(zhì)；通過人工突變研究某一位點(diǎn)（或區(qū)域）的改變對病毒遺傳性狀的影響。下面分別加以敘述。
（1） 病毒突變率研究：確定病毒突變率的方法有多種。首先，zui直接的方法是體外測定病毒基因組復(fù)制酶的錯(cuò)配率，如水皰性口炎病毒（VSV）RNA聚合酶的錯(cuò)配率為10-3.15，但在體內(nèi)聚合酶的錯(cuò)配率可能要更低一些；其次，病毒突變率可根據(jù)由一個(gè)純化克隆衍生而來的病毒基因組群體中核苷酸置換的頻率估計(jì)出來；或者由同一蝕斑衍生而來的大量病毒克隆的直接序列分析測定出來，后兩種方法或許不能地反映病毒突變率，因?yàn)槟承┩蛔兪侵滤佬缘?，而且傳代次?shù)不易確定。除直接測定序列外，也可通過以下方法間接獲得病毒的突變率：①從一個(gè)病毒克隆株中呈現(xiàn)特定表型的變異株出現(xiàn)的頻率估計(jì)突變率。溫度敏感性生長特性、蝕斑形態(tài)學(xué)、宿主范圍以及致病性等表型受幾種基因上不同突變的影響，顯然不適于進(jìn)行突變率的研究，不過，如果突變株及其回復(fù)突變株的突變性質(zhì)清楚的話，某一表現(xiàn)型改變的變異株的回復(fù)突變頻率可用于測定堿基置換率。Bos和Nayak（1986）測出一個(gè)流感病毒ts-變異株的突變率為10-3.5，Morita等（1987）報(bào)道了4個(gè)VSV ts-變異株的突變率分別為10-3.5、10-3.6、10-4.0和10-4.9；②測定野生型病毒克隆中抵抗病毒復(fù)制抑制劑的變異株出現(xiàn)的頻率以估計(jì)病毒突變率。Pincus等（1986）測得脊髓灰質(zhì)炎病毒胍抵抗性變異株出現(xiàn)的頻率為10-7.4和10-6.7之間，該突變表型需要2個(gè)獨(dú)立的突變，說明核苷酸置換率為10-3.7～10-3.4；③測定克隆中抵抗中和性單克隆抗體的變異株出現(xiàn)的頻率，這是報(bào)道應(yīng)用zui多的方法。 不同病毒因不同方法測定的突變率各不相同。例如，用單克隆抗體測定的流感病毒RNA置換頻率約為10-6，而根據(jù)ts-變異株回復(fù)突變以及直接序列分析相關(guān)的克隆RNA確定的結(jié)果為10-4；同樣地，VSV中和作用抵抗變異株出現(xiàn)的頻率比VSV ts- 變異株回復(fù)突變率（10-3.5～10-4.9）或直接序列分析VSV基因組RNA核苷酸置換獲得的突變率（10-3.7）低10～100倍。相反，直接分析脊髓灰質(zhì)炎病毒克隆測定的置換頻率（<10-5）比胍抵抗性變異株出現(xiàn)頻率和中和作用抵抗性變異株出現(xiàn)頻率低10～100倍。但無論怎樣，應(yīng)用同一種方法可以評價(jià)不同病毒的相對突變率。 有關(guān)DNA病毒突變率的資料較少，但似乎與RNA病毒相類似。單純皰疹病毒（HSV）的中和作用抵抗性變異株的突變率為≥10-5，犬細(xì)小病毒的中和作用抵抗性變異株的突變率為10-3.4和10-5.4之間。
（2） 人工篩選變異株：在動(dòng)物病毒變異研究中有實(shí)際意義的是獲得毒力低，而仍保持免疫原性的弱毒株，也就是針對病毒致病性這一遺傳學(xué)指標(biāo)進(jìn)行研究。動(dòng)物病毒的許多毒力變異株是人工培育的結(jié)果，概括起來有以下幾種減毒方法：[HT5K]異種動(dòng)物適應(yīng)性變異[HT5SS] 醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)上許多弱毒疫苗株就是利用通過自然條件下不感染或不易感染的所謂異種動(dòng)物這個(gè)途徑獲得的。將強(qiáng)毒株轉(zhuǎn)移到新宿主（一般常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物），開始時(shí)往往不引起或僅引起輕微的感染癥狀（或病變）。但是隨著傳代次數(shù)的增加，癥狀或病變逐漸增劇，甚至引起典型的發(fā)病、死亡。而此時(shí)往往減低了對其原宿主的毒力。例如豬瘟兔化弱毒株，就是多代通過兔體，在增高對兔體毒力的同時(shí)減低了其對原宿主（豬）毒力的豬瘟病毒株。同樣，兔化牛瘟毒株、鼠化和兔化口蹄疫毒株、鼠化馬瘟毒株等也都是適應(yīng)于異種動(dòng)物的典型例子。[HT5K]異常感染途徑適應(yīng)性變異[HT5SS] 將病毒通過非正常感染途徑接種，也可達(dá)到使毒力致弱的目的。朱既明等在將森林腦炎病毒株對乳鼠進(jìn)行連續(xù)的腦內(nèi)接種傳代后，在腹腔或皮下注射時(shí)的毒力逐步降低，傳代40次后，皮下注射基本上不能致病。黃熱病病毒也有這樣的例子，泛嗜性黃熱病病毒經(jīng)小鼠腦內(nèi)連續(xù)接種傳代后變?yōu)槭壬窠?jīng)性，泛嗜性消失，非腦內(nèi)接種時(shí)不再呈現(xiàn)病原性。[HT5K]雞胚適應(yīng)性變異[HT5SS] 30年代發(fā)展起來的雞胚培養(yǎng)技術(shù)，對病毒培養(yǎng)和弱毒疫苗株的培育起了巨大的推動(dòng)作用，至今它仍然是病毒學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)之一。雞胚化牛瘟病毒株、雞胚化乙型腦炎毒株、雞胚化狂犬病毒株等都曾成功地用作疫苗毒株。[HT5K]細(xì)胞適應(yīng)性變異 [HT5SS]40年代發(fā)展起來的組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成為病毒研究中的重要方法，也是目前應(yīng)用于弱毒株篩選中的主要手段。例如乙型腦炎病毒經(jīng)倉鼠腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞傳代后，對人及家畜的毒力明顯下降；麻疹病毒經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞傳代后對人的毒力下降等；犬肝炎病毒通過豬腎細(xì)胞培養(yǎng)，牛瘟病毒通過綠猴腎細(xì)胞培養(yǎng)，也都獲得了弱毒株。應(yīng)用同種動(dòng)物細(xì)胞，例如將豬瘟病毒和牛腹瀉—粘膜病病毒分別在豬白細(xì)胞培養(yǎng)物和牛腎細(xì)胞中傳代，也獲得了弱毒株。但因敏感細(xì)胞缺乏選擇性，病毒粒子不純。故以敏感細(xì)胞培育的弱毒株，應(yīng)再以蝕斑法或終點(diǎn)稀釋法進(jìn)一步純化。 必須指出的是，某些病毒的感染范圍很窄，即使應(yīng)用上述多代“強(qiáng)迫”接種方法，仍難適應(yīng)在異種動(dòng)物或細(xì)胞中增殖，當(dāng)然無法應(yīng)用這一手段達(dá)到減毒目的。[HT5K]ts-變異株和低溫適應(yīng)株的培育 [HT5SS]由于ts-變異株和低溫適應(yīng)株的毒力一般都較原毒株低。因此，應(yīng)用誘變劑選育ts-變異株以及應(yīng)用低溫培養(yǎng)方法培育低溫適應(yīng)株，已是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取得弱毒株的一個(gè)重要手段。這類變異株常可通過誘變劑處理同時(shí)進(jìn)行適當(dāng)選育的方法獲得。在已經(jīng)接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入亞硝酸、鹽酸羥胺或5溴脫氧尿核苷和2氨基嘌呤作誘變劑，雖然絕大多數(shù)病毒此時(shí)已經(jīng)滅活，但仍可能殘存少數(shù)病毒保持活力，這些病毒在上述誘變劑的作用下發(fā)生突變經(jīng)過一定程度的增殖之后，即有可能從中選育出ts-突變株。例如Sambrook等（1966）應(yīng)用5溴脫氧尿核苷和2氨基嘌呤作誘變劑，加入已經(jīng)接種兔痘病毒的雞胚成纖維細(xì)胞的維持液中，再經(jīng)蝕斑選育，獲得只能在34.5℃（稱為允許溫度）而不能在39.5℃（稱為非允許溫度或限制溫度）增殖的突變株；Williams（1971年應(yīng)用亞硝酸、羥胺和5溴脫氧尿核苷等作誘變劑，育成了40個(gè)腺病毒ts-突變株，可在31℃生長，但不能在38℃增殖；Pringle（1971）在培養(yǎng)液內(nèi)加入5氟尿嘧啶，隨后作蝕斑分離，由881個(gè)VSV克隆株中選育出9個(gè)穩(wěn)定的ts-變異株，這些ts-變異株可在31℃增殖，但不能在40℃增殖。 目前已在流感病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、水皰性口炎病毒、腺病毒、呼腸孤病毒、腦炎病毒和多型瘤病毒等多種病毒中，通過類似方法獲得了ts-變異株。[HT5K]重組試驗(yàn) [HT5SS]不僅是研究病毒遺傳學(xué)，特別是了解病毒基因的排列組合及
其與表現(xiàn)性狀之間的關(guān)系等的一個(gè)重要手段，也是培育或創(chuàng)造新毒株的一個(gè)有效途徑。 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重組試驗(yàn)常在培養(yǎng)細(xì)胞或雞胚中進(jìn)行。親本株必須盡可能純化，而且兩個(gè)親本株之間至少需要具有兩個(gè)以上的性狀差別。將兩個(gè)親本株混合感染培養(yǎng)細(xì)胞或雞胚以后，收獲子代病毒，并作純系分離，選育其中具備兩個(gè)親本株“雜交”性狀的新毒株，即為重組型。例如一個(gè)重組型流感病毒可以具有來源自一個(gè)親代病毒株的血凝素和另一個(gè)親代病毒株的神經(jīng)氨酸酶。Tumova等（1965）應(yīng)用活的甲2型流感病毒和紫外線滅活的雞瘟病毒混合感染雞胚組織培養(yǎng)細(xì)胞，獲得一株具有雞瘟病毒蝕斑形成能力和甲2型流感病毒不耐熱血凝素特性的重組型病毒，此株病毒同時(shí)含有上述兩種病毒的株特異性抗原。熊光明用口蹄疫病毒（FMDV）和豬腸道病毒（EV）混合感染IBRS2細(xì)胞，經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮Y選、克隆，鑒定了一個(gè)具有FMDV和EV抗原特性的重組病毒株。