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    轉(zhuǎn)印到紙上的蛋白質(zhì)抗原，可與其專一性抗體結(jié)合，再以二次抗體-酶結(jié)合體（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群轉(zhuǎn)印色帶中，專一性地挑出目標(biāo)蛋白質(zhì)，是zui有用的檢定工具 （Burnett,1981）。

 

    藥品試劑：

    抗體溶液：可用傳統(tǒng)抗血清或單株抗體，其zui適使用濃度，隨抗體效價(jià)不同而異，以下為一般適用范圍的參考，均以明膠-NET 稀釋的。

    a. 傳統(tǒng)抗血清： 1:100 到1:1,000

    b. IgG （冷凍干燥品）： 10~50 μg/mL

    c. 單株抗體 （小白鼠腹水） ： 1:200到1:5,000

    d. 單株抗體 （細(xì)胞培養(yǎng)液）： 原液或1:10明膠-NET：用來稀釋抗體溶液或酶聯(lián)體明膠gelatin （Merck 4070, 0.25%） 5.0 gm；NaCl （0.15 M） 17.5 gm；EDTA （5 mM） 3.6 gm；Tween-20 （0.05%） 1.0 mL；Tris （Tris base, 50 mM） 12.1 gm加熱溶解于1,800 mL 純水后pH 調(diào)到8.0，再加水到 2,000 mL

    酶聯(lián)體：

    可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP，使用濃度每家商品不同，約為1:1,000到1:5,000 的間，以明膠-NET 稀釋的。

    PBST 洗液

    DAB 基質(zhì)溶液：DAB （diaminobenzidine, Sigma D-5637） 5 mg溶于100 mL Buffer A-0，再加10 μL H2O2，新鮮配制，避光貯存。 DAB 為致癌物質(zhì)，稱量時(shí)勿吸入DAB 細(xì)塵，并小心處理秤量紙。

 

    方法步驟：

    1） 尿素洗過夜的轉(zhuǎn)印紙?jiān)僖?0 mL PBST 洗三次，每次約10 min，均在上述方形培養(yǎng)皿中進(jìn)行。

    2） 轉(zhuǎn)印紙放在明膠NET 溶液中反應(yīng)，置室溫中反應(yīng)1 h。一般使用方形培養(yǎng)皿當(dāng)容器，但亦可裝入塑料袋中反應(yīng)，較節(jié)省試劑用量。

    3） 反應(yīng)后，以PBST 浸洗二次。

    4） 把轉(zhuǎn)印紙放在抗體溶液中反應(yīng)，置室溫反應(yīng)1 h。

    5） 反應(yīng)后以PBST 洗三次，改用酶聯(lián)體反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1 h。

    6） 以PBST 洗四至五次，注意容器也要洗干凈。

    7） 加入DAB 基質(zhì)溶液約10 mL 呈色，盡量避光，并且不時(shí)搖動呈色液。

    8） 數(shù)分鐘內(nèi)可呈色，在背景加深前倒去DAB，以水沖過數(shù)次后晾干。