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禽流感的實(shí)驗(yàn)室診斷
閱讀：665 發(fā)布時(shí)間：2011-6-16由A型流感病毒引起的禽流感，其臨床癥狀因感染禽的年齡、種類、飼養(yǎng)管理水平、并發(fā)感染情況及新感染毒株的毒力等不同而表現(xiàn)不一致。其病理變化因感染病毒株毒力的高低、病程的長(zhǎng)短及種類不同也不盡相同。因此，禽流感的診斷一直依賴于病原的分離鑒定，OIE也一直采取的是進(jìn)行病毒分離鑒定這個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)。隨著血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，禽流感診斷技術(shù)的研究也取得了新的進(jìn)展。
對(duì)于禽流感傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法是用雞胚或者狗腎細(xì)胞（MDCK）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）等進(jìn)行病毒分離，采用血凝和血凝抑制進(jìn)行鑒定，血清學(xué)的診斷方法則包括中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，禽流感的診斷技術(shù)也越來(lái)越完善，現(xiàn)在已經(jīng)有免疫印跡、免疫熒光、ELISA、墓因芯片、RT-PCR技術(shù)、熒光RT-PCR技術(shù)、NASBA技術(shù)等。
如果要檢驗(yàn)是否是高致病性禽流感病毒，在進(jìn)行HA亞型鑒定之后，還需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物試驗(yàn)或進(jìn)行裂解位點(diǎn)的序列分析等進(jìn)行判斷。因?yàn)镺IE判斷HPAIV的標(biāo)準(zhǔn)是：①含流感病毒尿囊液，做l：10稀釋，靜脈內(nèi)接種8只4～8周齡易感雞，每只0．2ml，如在10天內(nèi)死亡6只以上，則該流感病毒為HPAIV~②如果致死l一5只易感雞，而且又不是H5或H7亞型，則將其接種雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或MDCK細(xì)胞，在沒(méi)有胰酶的情況下觀察是否產(chǎn)生細(xì)胞病理變化，如不產(chǎn)生病理變化，該流感病毒就不是HPAIV；③對(duì)于所有的低致病性H5和H7亞型病毒和其他流感病毒，如果在沒(méi)有胰酶的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)能生長(zhǎng)，則必須測(cè)定血凝素裂解部位的氨基酸順序，如果相似于其他的HPAIV，存在多個(gè)堿性氨基酸序列，則該受檢病毒被視為高致病性。
1．樣品采集
樣品采集的質(zhì)量是進(jìn)行禽流感檢測(cè)的關(guān)鍵。應(yīng)從死禽和處于急性發(fā)病期的病禽采集樣品，樣品要具有典型性。采樣過(guò)程要注意無(wú)菌操作，同時(shí)避免污染環(huán)境。采樣人員要按NY／丁7（38要求加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。樣品的保存和運(yùn)輸也要按照有關(guān)的規(guī)定和要求進(jìn)行。
（1）病料樣品 至少?gòu)?只病禽和病死禽中采集病料樣品（發(fā)病群不足5只則全部采樣）。樣品應(yīng)包括：泄殖腔（新鮮糞尿樣）棉拭子和氣管棉拭子（置于緩沖液中）；氣管和肺的混樣；腸管及內(nèi)容物的混樣；肝、脾、腎和腦等其他組織樣品（不能混樣）。
組織樣品、氣管棉拭子單獨(dú)放人容器，容器中盛放含有抗生素（pH值為7．0～7．4）的PBS液。抗生素的選擇應(yīng)視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中加入青霉素（20001U／ml）、鏈霉素（2mg／ml）或慶大霉素（50t~g／m1）。腸管及內(nèi)容物、糞便樣品和泄殖腔棉拭子所用的抗生素濃度應(yīng)提高5倍（加入抗生素后PBS液的pH值應(yīng)調(diào)至7．0-7．4）。
（2）血樣 分別采集至少10個(gè)病禽的（急性發(fā)病期血清，如發(fā)病群不足10只則全部采樣），并要求單獨(dú)存放，不能混合。
2．病毒的分離鑒定
以無(wú)菌拭子采集氣管或泄殖腔病料或病變組織，研磨制成10％懸液，經(jīng)處理后接種9-11日齡SPF雞胚，收獲尿囊液測(cè)定血凝活性，若為陰性則應(yīng)繼續(xù)盲傳2～3代。對(duì)具有血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI試驗(yàn)，以排除新城疫的可能，即使ND陽(yáng)性也應(yīng)采用中和法繼續(xù)傳代，看是否為ND與AIV混合感染。然后用免疫擴(kuò)散等方法來(lái)檢測(cè)特異性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時(shí)，進(jìn)行致病力試驗(yàn)，確定毒力的強(qiáng)弱。
雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn) 雞胚的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒；雞胚是個(gè)整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造；來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無(wú)菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。3天可報(bào)告結(jié)果。病毒分離鑒定對(duì)AI的診斷比較確實(shí)，但操作程序繁雜，費(fèi)用高，耗時(shí)費(fèi)力。