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          公司動態(tài)

          原位免疫PCR的IHC增敏方法

          閱讀:607          發(fā)布時間:2010-7-9

          (一)基本原理
          Sano等(1992)利用基因工程的方法表達(dá)了A蛋白與鏈霉親和素的嵌合體分子獲得成功,建立了免疫PCR技術(shù)。這是一種新的抗原檢測系統(tǒng),利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù),巧妙地將抗原抗體反應(yīng)的特異性同PCR的敏感性相結(jié)合,通過構(gòu)建單克隆抗體與重組核酸的嵌合體分子,使得利用PCR技術(shù)檢測蛋白成為可能。隨后在免疫PCR的基礎(chǔ)上,建立了在細(xì)胞或組織原位檢測抗原的原位免疫PCR(in situ immuno-PCR)。
          原位免疫PCR是一種檢測系統(tǒng),需要一種中介分子同時具有與DNA和抗體分子特異性結(jié)合的能力,其一端連接DNA,另一端連接抗原—抗體復(fù)合物,形成一個抗原—抗體—DNA連接物。作為標(biāo)記的DNA分子用PCR擴(kuò)增,檢測特異的PCR產(chǎn)物,即可間接證明抗原的存在。該技術(shù)與原位PCR不同,就是在PCR與原位雜交之間加了抗體的因素。原位PCR是先對切片或涂片進(jìn)行PCR,以對組織細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增,使其拷貝數(shù)大大增加,然后再進(jìn)行原位分子雜交。而該技術(shù)是先用特異性抗體(單抗)與相應(yīng)或目的抗原反應(yīng)。這個抗體在對抗原反應(yīng)之前加上了人體不存在的或無關(guān)的DNA序列??贵w與抗原特異性反應(yīng)后,用PCR擴(kuò)增加在抗體上的DNA序列,然后再用該DNA序列的探針進(jìn)行雜交檢測,也就是說用PCR及雜交的方法來放大免疫組織化學(xué)的反應(yīng),檢測目標(biāo)是蛋白質(zhì)。
          (二)操作流程
          (1)4um石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
          (2)0.3%H202處理20min;PBS洗3min×3。
          (3)抗原修復(fù),或3mol/L酶消化;PBS洗3rain×3
          (4)加入特異性一抗,37℃,1h;PBS洗3min× 3。
          (5)加人生物素化二抗(1:400),37℃,1h;PBS洗3min× 3。
          (6)加入鏈霉親和素(1:100),37℃,1h;PBS洗3rain× 3。
          (7)加人生物素化pUCl9 DNA;20ng/片37℃,1h;PBS洗3min× 3。
          (8)PBS洗,進(jìn)行原位PCR反應(yīng)(在原位PCR儀上進(jìn)行)。50×反應(yīng)液中含25umol/L引物1ul,2mmol/L dUTPs(1mmol/L dTTP和生物素—dUTP、20mmol/L dATP和dCTP)各lul,10X緩沖液5ul,Taq酶2U。原位PCR程序為:94℃,40s;55℃,40s;72℃,20s;循環(huán)30次,zui后72℃延伸5min;PBS洗3min×3。
          (9)加入鏈霉親和素—HRP(1;200),37℃,30rain;PBS洗3min×3。
          (10)DAB+H202顯色。
          (11)常規(guī)蘇木精襯染和封片。
          (三)應(yīng)注意的問題
          (1)防止非特異性染色。所用的外源性DNA片段和引物必須和人體內(nèi)基因或被檢靶細(xì)胞中無互補系列,防止非特異性結(jié)合,出現(xiàn)假陽性。
          (2)采用尿素或微波抗原修復(fù)方法替代酶消化切片,避免微量殘存蛋白酶對Taq酶的降解,影響PCR擴(kuò)增的效率,使敏感性下降。
          (3)防止脫片,充分洗滌,防止非特異性結(jié)合和擴(kuò)散。
          (4)必須設(shè)計各種陽性和陰性對照。
          以上方法主要是增加免疫組化敏感性的方法,當(dāng)然再敏感也應(yīng)保持特異性,不然提高敏感性就毫無意義,敏感性是在保留特異性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。
           

           

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