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在生物醫(yī)學和臨床研究實踐中，經常需要檢測兩種不同物質是否在同一樣品中共存或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學雙重染色。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學和免疫熒光細胞化學法結合；同一切片的再度染色法（先對*種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照）；兩種酶標抗體3又重染色（分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色）；不同種屬來源的抗體雙重染色。目前，zui常用的是zui后一種方法。

不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應．特異性較高，即使細胞內抗原量很少也能檢測。但是，當兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高，占優(yōu)勢時將妨礙另一種抗原染色，此種情況應分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應用zui多的是把SABC法或SP法的實驗流程重復兩次，其中兩種不同特異性抗體（可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個組合），與一抗對應的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。該方法用于石蠟切片時應考慮所選擇的兩個抗體的修復方法應該一致或一個抗體的修復對另一個抗體的染色結果沒有影響。

SP法雙重染色步驟
1～6步驟與SABC法相同，但無需使用生物素阻斷劑：
7．切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C過夜孵育后，PBS沖洗3次，每次5分鐘
8.滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘；
9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
10．堿性磷酸酶顯色液（BCIP／NBT）顯色（紫藍色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘；
11．滴加0．05％鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）；
12．滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37~C孵育10分鐘；
13．滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體），4~C過夜孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘；
14．滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：
15．滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
16．過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘
17．蘇木精復染細胞核；
18．水溶性封片劑封片。

在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設計。購買免疫組化雙染試劑盒時；應選擇與設計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應避免定位在細胞的同一部位（如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，選擇免疫熒光組織細胞化學雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光），它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認陽性結果。

在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預實驗，預實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預實驗結果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。