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丁酰膽*酯酶抑制劑活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5985

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝后可保存4周，避免反復凍融該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實際質量相同。

2. 試劑四：臨用前加入6mL試劑二，充分溶解，用不完的試劑-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融。

3. 試劑五：10mmol/L利凡斯的明溶液。臨用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸餾水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配（此試劑用于陽性管實驗，選做）。

產(chǎn)品說明：

丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱血漿*堿酯酶，假性膽*酯酶，是一種絲*酸水解酶，由肝臟合成后進入血液，幾乎存在于所有動物組織中。與乙酰膽*酯酶（AchE）相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥等神經(jīng)毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點，BchE抑制劑被用于改善阿爾茨海默病患者記憶力減退、認知功能障礙等病征。

BchE催化丁酰膽*水解生成*堿，膽*與二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB），BchE抑制劑通過抑制BchE活性，減少丁酰膽*的水解。TNB在412nm處有吸收峰，可通過測定412nm處吸光度的變化，計算BchE抑制劑活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、天平、烘箱、粉碎儀/研缽/勻漿器、30-50目篩、超聲清洗儀、離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：將樣本烘干至恒重，粉碎，過30-50目篩之后，稱取約0.1g，加入1mL提取液，用超聲提取法進行提取，超聲功率300W，60℃，提取30min。12000rpm，25℃，離心10min，取上清，用提取液定容至1mL，待測。

2. 粉劑樣本：稱取適量樣本，加入適量提取液，配制成適宜濃度的溶液待測。

注：若粉劑樣本不溶于提取液，可先用合適的溶劑溶解，配制成100×或者更大濃度的溶液，再用提取液稀釋至1×濃度。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至412nm，分光光度計蒸餾水調零。

2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列試劑）

三、丁酰膽*酯酶抑制劑活性計算

1. 抑制率計算

丁酰膽*酯酶抑制劑

抑制率（%）=（ΔA_空白-ΔA_測定）÷ΔA_空白×100%。

2. IC₅₀計算

IC₅₀，即抑制劑半抑制濃度。對于確定對BchE有抑制作用的樣本，可配制成適當?shù)臐舛忍荻?，分別以樣本濃度為橫坐標，以抑制率為縱坐標作抑制曲線，以此計算得到抑制率為50%時的樣本濃度，即IC₅₀。

注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性和穩(wěn)定性，請嚴格控制反應時間和操作時間。

2. 樣本吸光度大于1.6或ΔA_測定接近ΔA_空白時，建議在樣本處理步驟增加組織樣本比例或將粉劑樣本配制成更高濃度的溶液再進行測定。當ΔA_測定小于0.004時，可以將樣本用提取液稀釋后再進行測定。

3. 若用于比較不同試劑、提取物、藥物或組織對BchE的抑制程度，必須將試劑、提取物、藥物或組織勻漿配制成相同濃度進行比較。

實驗實例：

1. 取0.1005g柚果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進行超聲提取，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.878-0.337）-（0.141-0.120）=0.520，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.520）÷0.975×100%=46.667%。

2. 取0.1014g柿果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進行超聲提取，離心后取上清，稀釋16倍后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.581-0.127）-（0.141-0.120）=0.433，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.433）÷0.975×100%=55.590%。

3. 取10μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.631-0.126）-（0.141-0.120）=0.484，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.484）÷0.975×100%=50.359%。

參考文獻：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.

[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.

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