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4-香豆酸：輔*A連接酶（4CL）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號: BC4220
規(guī)格: 50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻；

2. 試劑二：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：臨用前用6 mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑五：加入1 mL乙醇溶解，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5. 工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
4-香豆酸：輔*A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔*A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下測有特征吸收峰，測定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫臺式離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟：

• 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至333nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表（在1.5mLEP管中進(jìn)行下列操作）：

三、4CL活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg組織蛋白每小時生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個酶活力單位。
4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=476.19×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算：

單位定義：每g組織每小時生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個酶活力單位。
4CL（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=476.19×ΔA÷W

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個酶活力單位。
4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.9124×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：4-香豆酸輔*摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 若ΔA大于0.5，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定。

2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時間。

3. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。

實驗實例：

1. 取0.1g芥菜加1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得ΔA測定管=A2測定管-A1測定管=0.784-0.655=0.129，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.129，按樣本質(zhì)量計算酶活得：4CL（U/g 質(zhì)量）=476.19×ΔA÷W=476.19×0.129÷0.1=614.29 U/g 質(zhì)量。

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