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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC3290
規(guī)格：25T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取試劑二A加入8 mL試劑一，緩慢加熱，逐漸升溫使其溶解，冷卻后加入試劑二B和試劑二C混合溶解，這樣可以分兩批配制并且測(cè)定，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

2. 試劑三：臨用前試劑三B加入試劑三A溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑四：臨用前先離心，取7 μL試劑四加入2.24 mL溶解好的試劑三混合備用（約14T），現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制。

4. 試劑五：臨用前取試劑五B和試劑五C加入試劑五A中溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

5. 試劑六：臨用前取1支加入208 μL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

6. 試劑七：臨用前加入2mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存8周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：
GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。
GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過反應(yīng)體系中添加的丙 酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP⁺還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過340nm下測(cè)定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。


注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在EP管中按順序加入下列試劑

混勻后立即在340nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。
三、GBSS活性計(jì)算
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V測(cè)]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V測(cè)]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V測(cè)：測(cè)量體積，0.78mL；V反總：反應(yīng)體積，0.62mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；ε：NADPH消光系數(shù)，6.22×10^-3mL/(nmol^.cm)；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g肝臟加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA=A2-A1=0.19-0.178=0.012，按樣本質(zhì)量計(jì)算：GBSS活性（U/g 質(zhì)量）=43.2×ΔA÷W=5.184 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g柳樹加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA=A2-A1=1.919-1.915=0.004，按樣本質(zhì)量計(jì)算：GBSS活性（U/g 質(zhì)量）=43.2×ΔA÷W=1.728 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

1. Jiang H, Dian W, Wu P. Effect of high temperature on fine structure of amylopectin in rice endosperm by reducing the activity of the starch branching enzyme[J]. Phytochemistry, 2003, 63(1): 53-59.

相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0700/BC0705  淀粉含量檢測(cè)試劑盒
BC1850/BC1855  可溶性淀粉合成酶（SSS）活性檢測(cè)試劑盒
BC1860/BC1865  淀粉分支酶（SBE）活性檢測(cè)試劑盒

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)活性檢測(cè)試劑盒