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超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒 抗氧

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū) 詳見(jiàn)附件
可見(jiàn)分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC0170
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：使用前先使用掌上離心機(jī)離心至管底再吹打混勻；

2. 試劑二工作液：根據(jù)樣本數(shù)量按試劑二：蒸餾水=30μL：270μL（共300μL，約5S）的比例配制試劑二工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 試劑四工作液：根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=60μL：240μL（共300μL，約10T）的比例配制試劑四工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

SOD（EC 1.15.1.1）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，是重要的氧自由基清除劑，能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
通過(guò)*及*氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O₂^-)，O₂^-可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560nm處有吸收；SOD可清除O₂^-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說(shuō)明SOD活性愈低，反之活性越高。血清或者SOD酶活小的樣本更適合使用BC5160超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒（WST-1法）進(jìn)行測(cè)定。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500-1000:1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3. 血清（漿）樣本：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 臨用前根據(jù)樣本數(shù)量取部分試劑一、試劑三和試劑四工作液37℃水浴5min以上。

3. 樣本測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃水浴30min后，置于1mL玻璃比色皿測(cè)定560nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定、A對(duì)照、A1空白、A2空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA空白=A1空白-A2空白。如底部有沉淀，混勻后再行測(cè)定。（空白管1和空白管2各只需做1~2管，每個(gè)樣本有一個(gè)對(duì)照管）

• SOD活性計(jì)算

1、抑制百分率的計(jì)算：抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測(cè)定) ÷ΔA空白× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)，越靠近50%越準(zhǔn)確。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣本；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本或者提高操作表中樣本體積，同時(shí)減少相同的蒸餾水體積。
2、SOD酶活性單位：在上述*氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位。
3、SOD酶活性計(jì)算：
（1）血清（漿）SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F
（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計(jì)算：

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷（1-抑制百分率）×V反總]÷（V樣×Cpr）×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

1. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

SOD活性 (U/g 質(zhì)量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

SOD活力 (U/10⁴ cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(N×V樣÷V樣總)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F÷N
V反總：反應(yīng)體系總體積，1 mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本的體積，0.09mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以萬(wàn)計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。
注意事項(xiàng)：

1. 樣本和試劑二工作液使用時(shí)在冰上放置。

2. 樣本較多時(shí)，可按表格配制測(cè)定管工作液和對(duì)照管工作液（包含試劑一、（試劑二工作液）、試劑三、蒸餾水），試劑四工作液必須最后加入。

3. 反應(yīng)完成后，可能有沉淀生成，混勻后測(cè)定即可。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g綠蘿葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.532-0.085=0.447，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.853-0.002=0.851，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測(cè)定) ÷ΔA空白×100%=47.5%，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

SOD活性 (U/g 質(zhì)量)= 11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W=100.5U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g小鼠腎臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.608-0.109=0.499，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.853-0.002=0.851，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測(cè)定) ÷ΔA空白× 100% =41.4%，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

SOD活性 (U/g 質(zhì)量)= 11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W=78.5U/g 質(zhì)量。

1. 取1000萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL提取液提取離心，之后再按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.614-0.015=0.599，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.853-0.002=0.851，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測(cè)定) ÷ΔA空白× 100% =29.6%，按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

SOD活性 (U/10⁴ cell)=抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總 ÷(1000×V樣÷V樣總)=0.0046U/10⁴ cell。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Beibei Li,Yang Ding, Xiuli Tang, et al. Effect of L-Arginine on Maintaining Storage Quality of the White Button Mushroom (Agaricus bisporus). Food and Bioprocess Technology. April 2019; 12:563-574.(IF3.032)

2. Yanan Wang,Cheng zhen Liang,Zhigang Meng, et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019; 162: 364-373. (IF3.712)

3. Yang Yang,Li Jing,Wei Cong, et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice. Phytomedicine. June 2019;59. (IF4.18)

4. Siyang Yu,Bo Dong, Zhenfei Fang, et al. Knockdown of lncRNA AK139328 alleviates myocardial ischaemia/reperfusion injury in diabetic mice via modulating miR-204-3p and inhibiting autophagy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. July 2018;(IF4.658)

5. Qilong Wang, Guosheng Xiao, Guoliang Chen, et al. Toxic effect of microcystin-LR on blood vessel development. Toxicological & Environmental Chemistry. February 2019;(IF3.547)

參考文獻(xiàn)：

1. Spitz D R, Oberley L W. An assay for superoxide dismutase activity in mammalian tissue homogenates[J]. Analytical Biochemistry, 1989, 179(1):8-18.

2. Masayasu M, Hiroshi Y. A simplified assay method of superoxide dismutase activity for clinical use[J]. Clinica Chimica Acta, 1979, 92(3):337-342.

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