目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC0385丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢客服 | 純度 | 詳詢客服 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢客服 | 分子式 | 詳詢客服 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC0385 | 應用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 丙酮酸脫氫酶活性測定 |
丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒說明書 微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0385
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法
丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體7.5mL×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體13mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑六 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑七 | 液體4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存。
2. 工作液的配制：臨用前把5.75mL試劑四、一支試劑五、0.45mL試劑六、1.75mL試劑七轉(zhuǎn)移到一瓶試劑三中混合溶解待用（共15.45mL，約85T）；用不完的試劑-20℃分裝保存，可保存4周。避免反復凍融。
產(chǎn)品說明：
PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致605nm光吸收的減少。
Pyruvic Acid + Thiamine Pyrophosphate Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate
Dichlorophenolindophenol(605nm) + Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate Reduced Dichlorophenolindophenol
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：稱取約 0.1g 組織，加入1mL 試劑一和 10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000g離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 細胞或者細菌樣本：先收集500萬細胞或細菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；之后加入1mL試劑一和 10μL試劑二，冰浴超聲波破碎細菌（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后11000g，4℃，離心10 min，
取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）及其它液體樣本：直接檢測。若溶液有渾濁則離心后去上清進行測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。
2、 每個樣本需要180μL工作液，根據(jù)實驗所需取出一定量的工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中水浴10min。
3、 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混勻，立即記錄605nm處10s處吸光值A1和 1min10s后的吸光值A2，計算ΔA空白=A1-A2。空白管只需測1-2次。
4、 測定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本，混勻，立即記錄605nm處10s處吸光值A3和1min10s后的吸光值A4，計算ΔA測定=A3-A4。
三、PDH活性計算
a.用微量比色皿測定的計算公式如下
1. 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr
2. 按樣本質(zhì)量計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W
3. 按細菌或細胞數(shù)量計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/104 cell）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×500)÷T
=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)
4. 按樣本體積計算
單位的定義：每mL液體在反應體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/mL）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T
=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)
V反總：反應體系總體積，1.9×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1．按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr
2．按樣本質(zhì)量計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=1827.62×(ΔA測定-ΔA空白)÷W
3．按細菌或細胞數(shù)量計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/104 cell）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T
=3.655×(ΔA測定-ΔA空白)
4．按樣本體積計算
單位的定義：每mL液體在反應體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U/mL）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T
=1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)
V反總：反應體系總體積，1.9×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L/mol/ cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
注意事項：
1、測定過程中所有樣本在冰上放置并于2小時內(nèi)檢測，以免變性和失活。
2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。若測定管的ΔA值小于0.01，需加大樣本量后重新測定，注意同步修改計算公式。
3、由于試劑一中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去試劑一的蛋白含量。
實驗實例：
1、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL試劑一和10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4℃、11000g離心10min，取上清置冰上，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
PDH活性(U/g質(zhì)量)= 913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W=1747 U/g質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻：
[1] Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility[J]. Phytomedicine, 2019, 58: 152745.
參考文獻：
[1] Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localizes to mitochondria and enhances pyruvate dehydrogenase activity in skeletal myotubes[J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0710/BC0715 α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性檢測試劑盒
BC2150/BC2155 檸檬酸（CA）含量檢測試劑盒
BC0950/BC0955 琥珀酸脫氫酶（SDH）活性檢測試劑盒
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