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糖酵解系列試劑盒己糖激酶（HK）測(cè)試盒
貨號(hào)：BC0740
規(guī)格：50管/48樣
 

測(cè)定意義
    HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的*個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

測(cè)定原理
     HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品
    紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 30mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 30mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑 4℃
保存一周；
試劑三：液體 5 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑 4℃
保存一周；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2mL 蒸餾水充分溶解備用；現(xiàn)配現(xiàn)用；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 試劑一和 250μL 蒸餾水充分溶解備用；
用不完的試劑 4℃保存一周；

樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（10 4 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，
加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一、二、三、四和五 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。
3、 加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在 340 nm
波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。
 

注意事項(xiàng)
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、五和六按比例配成混合液，預(yù)
熱 10min。
2、不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做 1-2 只預(yù)試，若 ΔA>0.5，則說(shuō)明
組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），
或縮短反應(yīng)時(shí)間 2min,使 ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。
HK 活性計(jì)算
1、血清（漿）HK 活性
單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9 ]÷V 樣÷T=1113×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9 ]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9 ]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1113×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（nmol/min /10 4 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9 ]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.226×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.038×10 -3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3 L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)
胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

糖酵解系列試劑盒己糖激酶（HK）測(cè)試盒