單個(gè)核細(xì)胞分離液系列

本品為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用

于從血液或組織中分離單個(gè)核細(xì)胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。

其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及

細(xì)胞帶電不同，所以用戶(hù)在定制分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物的種屬及被分離細(xì)

胞的名稱(chēng)。

本系列產(chǎn)品目錄

1. 適用于各種動(dòng)物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項(xiàng)

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

6. 貯藏及保存期限

7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

8. 使用方法說(shuō)明及圖例

8.1 血液樣本分離液使用說(shuō)明及圖例

8.2 組織分離液使用說(shuō)明及圖例

9. HES-TBD550 使用說(shuō)明

10. 組織單細(xì)胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

12. 參考文獻(xiàn)

1. 適用于各種動(dòng)物血液及組織 于各種動(dòng)物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索：：：

貨號(hào)                     品牌              產(chǎn)品名稱(chēng)          規(guī)格         報(bào)價(jià)

LDS1075 人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液（FICOLL 配置） 200ml 400.00

LDS1075P 人臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液（FICOLL 配置） 100ml 400.00

LDS1075Z 人腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1080 大鼠全血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1080P 大鼠臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1080Z 大鼠腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1090 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1090P 小鼠臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1090Z 小鼠腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1083 豚鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1083P 豚鼠臟器單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1083Z 豚鼠腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1088C 雞外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1088CP 雞臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1088CZ 雞腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1088D 鴨外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 600.00

LDS1088DP 鴨臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 600.00

LDS1088DZ 鴨腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 600.00

LDS1088G 鵝外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 600.00

LDS1088GP 鵝臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 600.00

LDS1088GZ 鵝腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 600.00

LDS1077 狗外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1077P 狗臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1077Z 狗腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1108 豬外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1108P 豬臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1108Z 豬腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1108C 豬腸粘膜組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1084 牛外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1084P 牛臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1084Z 牛腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1084Y 羊外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1084YP 羊臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1084YZ 羊腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1091 馬外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1091P 馬臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1091Z 馬腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1076 猴外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1076P 猴臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1076Z 猴腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1094 兔外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml 400.00

LDS1094P 兔臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1094Z 兔腫瘤浸潤(rùn)組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1079F 魚(yú)全血單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

LDS1079FP 魚(yú)臟器組織單個(gè)核細(xì)胞分離液 100ml 400.00

3. 注意事項(xiàng)

A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果，

且所有操作過(guò)程一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶(hù)可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實(shí)驗(yàn)室自定）。

D． 使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過(guò)堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過(guò)程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

 F． 分離過(guò)程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無(wú)菌、無(wú)病毒、無(wú)支原體、

低內(nèi)毒素水平且無(wú)細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. 應(yīng). 用

適用于從各種動(dòng)物血液或組織中分離單個(gè)核細(xì)胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無(wú)菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無(wú)微生物污染，啟封后可置 4℃長(zhǎng)期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. 實(shí)驗(yàn)材料 7. 實(shí)驗(yàn)材料

A． 試劑

單個(gè)核細(xì)胞分離液、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液、羥乙已基淀粉 550、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無(wú)菌工作臺(tái)

8.. . . 使用方法說(shuō)明及圖例 使用方法說(shuō)明及圖例

8.1. 血液樣本分離液使用說(shuō)明及圖例

A. 小量分離 A. 小量分離-使用 1-2ml 新鮮抗凝血（分離圖例見(jiàn)圖例 （分離圖例見(jiàn)圖例 1）：：

a. 取新鮮抗凝血 1-2ml，與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1:1 混勻；

b. 小心加于與混合液等體積的細(xì)胞分離液之液面上；

c. 以 400g（約 1500 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 4-5ml細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

B. 中量分離 B. 中量分離-使用 5-10ml 新鮮抗凝血（分離圖例見(jiàn)圖例 （分離圖例見(jiàn)圖例 1）：：

a. 取新鮮抗凝血 5-10ml，與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1:1 混勻；

b. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

c. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 10ml細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

C. 大量分離 C. 大量分離 I-使用 20ml 新鮮抗凝血（分離圖例見(jiàn)圖例 （分離圖例見(jiàn)圖例 2）：：

a. 取新鮮抗凝血 20ml 以 200g（約 1100 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘棄去血漿；

b. 向棄去血漿的血細(xì)胞 棄去血漿的血細(xì)胞中加入全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混勻；

c. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

d. 以 600g（約 2000 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個(gè)

核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 20ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

D. 大量分離 D. 大量分離 II-使用 50ml 新鮮抗凝血（分離圖例見(jiàn)圖例 （分離圖例見(jiàn)圖例 3）：：

 a. 取新鮮抗凝血50ml 與 HES 50ml HES----TBD550 液 1:1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30

℃靜置 20-30 分鐘。吸取混濁的上清液備用，棄去底部紅細(xì)胞。

 b. 將步驟 1 中留取的上清液以 200g（約 1100 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘棄去上清保留沉淀細(xì)

胞；

c. 向沉淀的細(xì)胞中加入全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混勻；

d. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

e. 以 600g（約 2000 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個(gè)

核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 20ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20

分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

注：：：：提取率約為 80%。。。。

 血液（人）中各細(xì)胞含量參考值 中各細(xì)胞含量參考值：：： ：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬(wàn)個(gè)/mm3

)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬(wàn)個(gè)/mm3 紅細(xì)胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬(wàn)個(gè)/mm3

)

成人：4.0-10.0×109

/L(4000-10000 個(gè)/mm3

) 白細(xì)胞 新生兒：15.0-20.0×109

/L（15000-20000 個(gè)/mm3

)

血小板 100-300×109

/L（10 萬(wàn)-30 萬(wàn)個(gè)/mm3

)

名稱(chēng) 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 占白細(xì)胞總數(shù)百分比

嗜中性粒細(xì)胞 30%-70%

嗜酸性粒細(xì)胞 0.5%-5%

嗜堿性粒細(xì)胞 0%-1%

淋巴細(xì)胞 20%-40%

白細(xì)胞分

類(lèi)計(jì)數(shù)

單核細(xì)胞 3%-8%

分離圖例 3

抗凝血 50ml 與 HES-TBD550 1：1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30℃靜置 20-30 分鐘

8.2 組織分離液使用說(shuō)明及圖例 8.2 組織分離液使用說(shuō)明及圖例

A．取組織勻漿單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml，具體制備方法參照“10.組織

單細(xì)胞懸液的制備”）2ml，小心加于 2ml 細(xì)胞分離液之液面上；

B．以 400g（約 1500 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為胎牛血清液層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單

個(gè)核細(xì)胞層。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 4-5ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20

分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

9. HES. . HES-TBD550 使用說(shuō)明

HES 是從支鏈淀粉衍生出來(lái)的，是富含淀粉的復(fù)合物，其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基

取代度即取代級(jí)、平均分子量決定。大量實(shí)驗(yàn)表明平均分子量越大對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用越強(qiáng)，

有效提高紅細(xì)胞的沉降速度，從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥

乙已基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、

骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在

細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴(kuò)增分化過(guò)程中操作技術(shù)等多種因

素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀

法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對(duì)細(xì)胞損傷較大，免疫磁珠法價(jià)格相對(duì)較貴且由于抗原抗體

反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國(guó)內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞，然后再進(jìn)行離心分離單個(gè)核細(xì)胞，也取得不錯(cuò)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每份臍血隨機(jī)分入兩個(gè)不同處理組，從而將臍血樣本的個(gè)體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實(shí)，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時(shí)還阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）處理后，可使紅細(xì)胞沉積至試管底，對(duì)其它主要成分包括干細(xì)胞無(wú)影響。經(jīng)這樣處理后，實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較短（平均為 1.5 h），步驟相對(duì)較少，細(xì)胞污染幾率小，從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明，與相應(yīng)的干細(xì)胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。

10.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備 組織單細(xì)胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法，，，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消 ，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消

化酶種類(lèi)各不相同，，，，請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)B.. .. 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境。。。

剪碎法：：：將組織塊放入平皿后 ： ，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購(gòu))過(guò)濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗3次，每次以500rpm短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109 個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法: 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。 計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿(mǎn)為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線(xiàn)的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線(xiàn)和左線(xiàn)者，

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：： ：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)

胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm2 時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混

勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線(xiàn)上時(shí)，則只計(jì)上線(xiàn)，不計(jì)下線(xiàn)，只計(jì)左線(xiàn)，不計(jì)右線(xiàn)。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：：： ：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

11. . . . 生產(chǎn)企業(yè)

12. . . . 參考文獻(xiàn)

［1］ Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal

brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear cells［J］. Pediatric

Research, 2006,59(2):244-249.

［ 2］ Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step［J］. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

［3］ 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質(zhì)干/ 祖細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］.

中華器官移植雜志,2003,24:220-222.

［4］ Dennis JE, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma

［J］. Stem Cells,2002,20(3):205.

［5］ Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage tendencies

in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord Blood［J］. Stem

Cells, 2006,24(3) : 679-685.

［6］ Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone marrow

［J］. Blood, 2001,98:2396-2402.

［7］ Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human exfoliated

deciduous teeth［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

［8］ 遲作華, 張 洹, 何冬梅, 等. 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)

科雜志,2006, 26(5):372-375.

［9］ 向 靜, 江德鵬, 王昌銘，等. 臍血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物

mRNA 的表達(dá)［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005 ,30 (3):352-355.

［10］ 孫海梅，季鳳清，李榮平，等.不同培養(yǎng)條件下人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的差異［J］. ***，

2006, 10( 45 )：51-53.

［11］ 朱美玲，伍新堯，陳汝光，等.不同分離方法分離臍血造血細(xì)胞效率的比較［J］. 中

國(guó)輸血雜志,2002 , 15 (3):179-780.

［12］ 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和

醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1999.

［13］ 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995.

［14］ 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社，2000.

??前???sa?f???ang=EN-US> 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109 個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法: 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。 計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿(mǎn)為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線(xiàn)的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線(xiàn)和左線(xiàn)者，

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：： ：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)

胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm2 時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混

勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線(xiàn)上時(shí)，則只計(jì)上線(xiàn)，不計(jì)下線(xiàn)，只計(jì)左線(xiàn)，不計(jì)右線(xiàn)。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：：： ：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

11. . . . 生產(chǎn)企業(yè)

12. . . . 參考文獻(xiàn)

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［ 2］ Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

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［3］ 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質(zhì)干/ 祖細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］.

中華器官移植雜志,2003,24:220-222.

［4］ Dennis JE, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma

［J］. Stem Cells,2002,20(3):205.

［5］ Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage tendencies

in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord Blood［J］. Stem

Cells, 2006,24(3) : 679-685.

［6］ Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone marrow

［J］. Blood, 2001,98:2396-2402.

［7］ Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human exfoliated

deciduous teeth［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

［8］ 遲作華, 張 洹, 何冬梅, 等. 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)

科雜志,2006, 26(5):372-375.

［9］ 向 靜, 江德鵬, 王昌銘，等. 臍血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物

mRNA 的表達(dá)［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005 ,30 (3):352-355.

［10］ 孫海梅，季鳳清，李榮平，等.不同培養(yǎng)條件下人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的差異［J］. ***，

2006, 10( 45 )：51-53.

［11］ 朱美玲，伍新堯，陳汝光，等.不同分離方法分離臍血造血細(xì)胞效率的比較［J］. 中

國(guó)輸血雜志,2002 , 15 (3):179-780.

［12］ 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和

醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1999.

［13］ 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995.

［14］ 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社，2000.