兔外周血單個核細(xì)胞分離液

為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用

于從血液或組織中分離單個核細(xì)胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。

其他人及動物多種比重細(xì)胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及

細(xì)胞帶電不同，所以用戶在定制分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物的種屬及被分離細(xì)

胞的名稱。

兔外周血分離液產(chǎn)品目錄

1. 適用于各種動物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準(zhǔn)備

8. 使用方法說明及圖例

8.1 血液樣本分離液使用說明及圖例

8.2 組織分離液使用說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細(xì)胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

12. 參考文獻

1. 適用于各種動物血液及組織 于各種動物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索：：：

貨號                     品牌              產(chǎn)品名稱          規(guī)格         報價

3. 注意事項

A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

 F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、

低內(nèi)毒素水平且無細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. 應(yīng). 用

適用于從各種動物血液或組織中分離單個核細(xì)胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. 實驗材料 7. 實驗材料

A． 試劑

單個核細(xì)胞分離液、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液、羥乙已基淀粉 550、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管水平轉(zhuǎn)子離心機、無菌工作臺

8.. . . 使用方法說明及圖例 使用方法說明及圖例

8.1. 血液樣本分離液使用說明及圖例

A. 小量分離 A. 小量分離-使用 1-2ml 新鮮抗凝血（分離圖例見圖例 （分離圖例見圖例 1）：：

a. 取新鮮抗凝血 1-2ml，與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1:1 混勻；

b. 小心加于與混合液等體積的細(xì)胞分離液之液面上；

c. 以 400g（約 1500 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 4-5ml細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

B. 中量分離 B. 中量分離-使用 5-10ml 新鮮抗凝血（分離圖例見圖例 （分離圖例見圖例 1）：：

a. 取新鮮抗凝血 5-10ml，與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1:1 混勻；

b. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

c. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 10ml細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

C. 大量分離 C. 大量分離 I-使用 20ml 新鮮抗凝血（分離圖例見圖例 （分離圖例見圖例 2）：：

a. 取新鮮抗凝血 20ml 以 200g（約 1100 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘棄去血漿；

b. 向棄去血漿的血細(xì)胞 棄去血漿的血細(xì)胞中加入全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混勻；

c. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

d. 以 600g（約 2000 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個

核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 20ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

D. 大量分離 D. 大量分離 II-使用 50ml 新鮮抗凝血（分離圖例見圖例 （分離圖例見圖例 3）：：

 a. 取新鮮抗凝血50ml 與 HES 50ml HES----TBD550 液 1:1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30

℃靜置 20-30 分鐘。吸取混濁的上清液備用，棄去底部紅細(xì)胞。

 b. 將步驟 1 中留取的上清液以 200g（約 1100 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘棄去上清保留沉淀細(xì)

胞；

c. 向沉淀的細(xì)胞中加入全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混勻；

d. 將混合液小心疊加于細(xì)胞分離液之液面上（混合液：：：分離液 ：=2==：=：：：1）；

e. 以 600g（約 2000 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為血漿層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單個

核細(xì)胞層。。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 20ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20

分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

注：：：：提取率約為 80%。。。。

 血液（人）中各細(xì)胞含量參考值 中各細(xì)胞含量參考值：：： ：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個/mm3

)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個/mm3 紅細(xì)胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個/mm3

)

成人：4.0-10.0×109

/L(4000-10000 個/mm3

) 白細(xì)胞 新生兒：15.0-20.0×109

/L（15000-20000 個/mm3

)

血小板 100-300×109

/L（10 萬-30 萬個/mm3

)

名稱 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 占白細(xì)胞總數(shù)百分比

嗜中性粒細(xì)胞 30%-70%

嗜酸性粒細(xì)胞 0.5%-5%

嗜堿性粒細(xì)胞 0%-1%

淋巴細(xì)胞 20%-40%

白細(xì)胞分

類計數(shù)

單核細(xì)胞 3%-8%

分離圖例 3

抗凝血 50ml 與 HES-TBD550 1：1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30℃靜置 20-30 分鐘

8.2 組織分離液使用說明及圖例 8.2 組織分離液使用說明及圖例

A．取組織勻漿單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個/ml，具體制備方法參照“10.組織

單細(xì)胞懸液的制備”）2ml，小心加于 2ml 細(xì)胞分離液之液面上；

B．以 400g（約 1500 轉(zhuǎn)/分）離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為胎牛血清液層。第二層；；；為環(huán)狀乳白色 ；為環(huán)狀乳白色單

個核細(xì)胞層。。。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含 4-5ml

細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20

分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需細(xì)胞。

9. HES. . HES-TBD550 使用說明

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復(fù)合物，其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基

取代度即取代級、平均分子量決定。大量實驗表明平均分子量越大對紅細(xì)胞的凝集作用越強，

有效提高紅細(xì)胞的沉降速度，從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥

乙已基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、

骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在

細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴增分化過程中操作技術(shù)等多種因

素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀

法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對細(xì)胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體

反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞，然后再進行離心分離單個核細(xì)胞，也取得不錯結(jié)果。實驗證明采用隨機數(shù)字表法，將每份臍血隨機分入兩個不同處理組，從而將臍血樣本的個體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實驗采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時還阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）處理后，可使紅細(xì)胞沉積至試管底，對其它主要成分包括干細(xì)胞無影響。經(jīng)這樣處理后，實驗時間相對較短（平均為 1.5 h），步驟相對較少，細(xì)胞污染幾率小，從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明，與相應(yīng)的干細(xì)胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。

10.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備 組織單細(xì)胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法，，，酶消化法由于各實驗室選取的消 ，酶消化法由于各實驗室選取的消

化酶種類各不相同，，，，請各實驗室自行選擇進行試驗B.. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。

剪碎法：：：將組織塊放入平皿后 ： ，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗3次，每次以500rpm短時低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細(xì)胞團塊。作細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細(xì)胞懸液備用。 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109 個/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計數(shù)方法: 細(xì)胞計數(shù)法是用來計數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）進行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。 計數(shù)與計算過程

1）、在細(xì)胞計數(shù)板*放置計數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線的細(xì)胞只計數(shù)在上線和左線者，

對于細(xì)胞團按單個細(xì)胞計數(shù)。

4）、按下式計數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計數(shù)要點：：： ：

A． 進行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計數(shù)時，遇到 2 個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)

胞計算。如果細(xì)胞團>10％，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混

勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團時，只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)

胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯誤：：： ：

A． 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

11. . . . 生產(chǎn)企業(yè)

12. . . . 參考文獻

［1］ Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal

brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear cells［J］. Pediatric

Research, 2006,59(2):244-249.

［ 2］ Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step［J］. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

［3］ 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質(zhì)干/ 祖細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞的實驗研究［J］.

中華器官移植雜志,2003,24:220-222.

［4］ Dennis JE, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma

［J］. Stem Cells,2002,20(3):205.

［5］ Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage tendencies

in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord Blood［J］. Stem

Cells, 2006,24(3) : 679-685.

［6］ Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone marrow

［J］. Blood, 2001,98:2396-2402.

［7］ Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human exfoliated

deciduous teeth［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

［8］ 遲作華, 張 洹, 何冬梅, 等. 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］. 中國實用內(nèi)

科雜志,2006, 26(5):372-375.

［9］ 向 靜, 江德鵬, 王昌銘，等. 臍血單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物

mRNA 的表達［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005 ,30 (3):352-355.

［10］ 孫海梅，季鳳清，李榮平，等.不同培養(yǎng)條件下人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的差異［J］. ***，

2006, 10( 45 )：51-53.

［11］ 朱美玲，伍新堯，陳汝光，等.不同分離方法分離臍血造血細(xì)胞效率的比較［J］. 中

國輸血雜志,2002 , 15 (3):179-780.

［12］ 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實驗血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和

醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1999.

［13］ 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995.

［14］ 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實驗方法.人民軍醫(yī)出版社，2000.