在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細菌，而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。

衛(wèi)生學意義：

大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。

GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法

什么是MPN法?

MPN法是統(tǒng)計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度，應用統(tǒng)計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

MPN值并不能表示實際菌落數(shù)，實際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點，MPN值是落在這個置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點。

靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。

大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗操作

操作注意事項

建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對細菌具有保護作用。

初發(fā)酵接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。

培養(yǎng)基檢查。加入樣品前應觀察導管內(nèi)是否有氣泡，若有，應適當傾斜試管，讓氣體排出。

結果觀察。某些食品樣品可能會堵塞小導管底部，影響導管內(nèi)氣泡的觀察，可將試管微微傾斜，用手指輕彈管壁，觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起，若有，則判定產(chǎn)氣。

培養(yǎng)基原理解析

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)：

? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。

? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。

? 如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。

煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)：

? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。

? 培養(yǎng)基配方當中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會與膽鹽發(fā)生反應，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。

大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報告

確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值

當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度)，使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度)，然后再遵循相關的規(guī)則進行查找，最終確定MPN值。

表B.1

大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

GB4789.3-2016大腸菌群計數(shù)平板法

大腸菌群平板計數(shù)法流程圖

操作注意事項

平板法相對MPN法來說，結果更加直觀精確。長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結果往往偏低。適用于污染較為嚴重的樣品。

從一個樣品取樣到傾注瓊脂平板，應在15分鐘內(nèi)完成。

檢驗所用物品應無菌，無抑菌殘留物。

BGLB確證試驗需從VRBA平板上挑起至少10個典型和可疑菌落進行，如平板上菌落數(shù)少于10個，則挑取全部典型和可疑菌落進行確證。

培養(yǎng)基原理解析

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)：

? 配方中膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。

? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

? 該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

大腸菌群定義：

選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。

證實試驗：

從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。

大腸菌群平板計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例：10^-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：

100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。

若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計算。

質(zhì)量控制

實驗室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。

為了控制環(huán)境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數(shù)瓊脂平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養(yǎng)，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，并進行記錄，次驗證實驗至少每2個月進行1次。

大腸菌群測試片法

原理

大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌?？捎糜谑称?、飲料等的大腸菌群計數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。

培養(yǎng)基原理解析

菌落計數(shù)特別方便(容易判讀)，紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現(xiàn)象；

菌落分布特別均勻；

避免了培養(yǎng)基對細菌熱損傷有關；

菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生；

經(jīng)濟環(huán)保無粉塵，體積小，重量輕，易儲運；

保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長。

使用說明