1.菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出來(lái)活化的話(huà)屬于第幾代？

答：保存的是第三代復(fù)活出來(lái)后，如果采用平板或肉湯活化相當(dāng)于轉(zhuǎn)接了一代，就是第四代，如果還在瓷珠里的話(huà)就還是原來(lái)的代數(shù)。如果是保存在斜面上，這一支斜面一直就是第三代，如果轉(zhuǎn)接到另一支斜面就是第四代。傳代原則，菌株活化復(fù)蘇不論以任何形式繁殖了一次就算是傳了一代。但如果僅是物理位置的轉(zhuǎn)移沒(méi)有繁殖就不是傳代。

2.菌株傳代保存到瓷珠里一定要挑單菌落嗎？

答：不一定非挑單菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是說(shuō)從同一個(gè)菌落純化出來(lái)的，以保證它們的特性一致。原則是盡量多挑，寧多勿少。

3.菌株冷凍保存是-70℃還是-80℃有具體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定么？

答：有標(biāo)準(zhǔn)。《SN/T 2632-2010 微生物菌株常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程》是關(guān)于菌株保藏的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，大家可以學(xué)習(xí)一下，各個(gè)保存方式都有介紹，但是瓷珠是比較新興的保存方式暫時(shí)里面還沒(méi)有收錄。GB4789.28-2013建議長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存是在不高于-70℃條件下。

4.怎樣延長(zhǎng)菌株的保存時(shí)間呢？

答：大量的實(shí)驗(yàn)證明菌株在低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)的條件下保存效果是很好的，越接近這種保存條件，菌株的保存時(shí)間越長(zhǎng)。例如甘油凍存管，在-80℃保存時(shí)間大于在-20℃。凍干菌粉在-20℃保存時(shí)間會(huì)比2~8℃長(zhǎng)。

5.怎樣純化菌株？

答：純化就是從可疑菌落平板上挑取單菌落再劃線(xiàn)到合適的非選擇性平板（如TSA、NA等）上，分離出單菌落的過(guò)程。

6. 我們只保存第一代菌株是不是要重新傳代保存呢，認(rèn)證老師會(huì)不會(huì)認(rèn)為這是個(gè)錯(cuò)誤？

答：一般情況下認(rèn)證老師不會(huì)提出這種問(wèn)題。最佳儲(chǔ)存方式應(yīng)該是，制備第一代菌株的甘油凍存管，置于超低溫冰箱進(jìn)行長(zhǎng)期保存。第二代菌株作為工作儲(chǔ)備菌株，進(jìn)行斜面保存。使用第二代工作儲(chǔ)備菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接后為第三代工作菌株。

7. 為何要將第三代作為工作菌株？

答：菌株在多次傳代后，菌株的變異概率會(huì)大大增加，因此菌株傳代需控制在五代以?xún)?nèi)，而第一代菌株通常相對(duì)不穩(wěn)定，需傳至第三代使菌株穩(wěn)定。因此實(shí)際工作中通常選擇第三代菌株作為工作菌株。

8. 質(zhì)控菌株是不是傳代超過(guò)五代就必須銷(xiāo)毀處理？

答：不一定。傳代超過(guò)五代只是存在菌種變異可能，但如果傳代到第六代、第七代……經(jīng)過(guò)形態(tài)、生化特性、DNA特征等驗(yàn)證，性狀保持穩(wěn)定，那么這些五代后的菌還是可以正常使用。

9.菌種編號(hào)意義？

答：以金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003為例，CMCC為中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心縮寫(xiě)，其它常見(jiàn)菌種保藏中心還包括ATCC（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所）、CICC（工業(yè)微生物菌種保藏中心）、FSCC（食品安全菌種保藏中心）；B的意思是細(xì)菌，對(duì)應(yīng)還有F（真菌）；26003為CMCC的保藏編號(hào)。

10.同樣是金黃色葡萄球菌，ATCC6538與ATCC25923有什么不同？

答：ATCC6538與ATCC25923均為來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）的菌株，不同的編號(hào)表明這兩株最初始的分離來(lái)源不同。但不同的編號(hào)的生化特性是否一樣，需要進(jìn)行具體分析。比如在實(shí)際生物學(xué)檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌ATCC6538溶血能力較ATCC25923要強(qiáng)。

11. 使用瓷珠保藏管保存菌株，加入菌液搖勻后為什么要吸干菌液？

答：瓷珠保存的原理為瓷珠為多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)菌吸附在瓷珠上，除去液體，則避免反復(fù)凍融時(shí)，液體冷凍過(guò)程中形成的冰晶損傷細(xì)菌，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)菌的作用。如果不吸干菌液的話(huà)，那么瓷珠保存就達(dá)不到可以進(jìn)行反復(fù)凍融的效果。

12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里嗎？

答：一般細(xì)菌的TSA斜面，2-8℃保存，即冷藏，但弧菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌等對(duì)低溫較敏感菌株，短期置于室溫20-25℃保存，長(zhǎng)期保存需使用甘油管或者瓷珠凍存。

13.復(fù)蘇凍干菌株是否可以采用液體培養(yǎng)基？

答：可以，但使用液體復(fù)蘇的話(huà)只能觀察到培養(yǎng)基混濁，無(wú)法確定是否有污染。建議使用平板培養(yǎng)基復(fù)蘇凍干菌株，有助于簡(jiǎn)單通過(guò)肉眼觀察菌落形態(tài)以分辨復(fù)蘇出來(lái)菌株是否存在污染，初步鑒定菌株純度。

14.復(fù)蘇凍干菌株是否可以采用顯色培養(yǎng)基？

答：不建議采用顯色培養(yǎng)基復(fù)蘇凍干菌株。凍干菌株在凍干過(guò)程中會(huì)受到一定的損傷，復(fù)蘇需要一個(gè)最適生長(zhǎng)環(huán)境，故復(fù)蘇培養(yǎng)基不能選用含有抑菌成分不利于菌株復(fù)蘇的這類(lèi)選擇性培養(yǎng)基（顯色培養(yǎng)基屬于選擇性培養(yǎng)基）。

15.產(chǎn)氣莢膜梭菌做凍存時(shí)是否需要保持厭氧狀態(tài)？

答：不需要。產(chǎn)氣莢膜梭菌雖屬厭氧性細(xì)菌，但對(duì)厭氧程度要求并不太嚴(yán)格，按照一般菌株凍存方法進(jìn)行凍存即可。如果是凍存嚴(yán)格厭氧菌，則需特殊的凍存方法。