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具有治療潛力的核酸和mRNA疫苗在制藥工業(yè)成為新的增長(zhǎng)點(diǎn)。其中寡核苷酸發(fā)展迅猛，寡核苷酸是由20到60個(gè)堿基組成的單鏈或雙鏈核酸片段。包括反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾RNA （siRNA）、microRNA以及適配體。在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。

寡核苷酸由于細(xì)胞外穩(wěn)定性低，溶劑被核酸酶解，同時(shí)難以進(jìn)入細(xì)胞等因素的影響發(fā)展緩慢，近些年，由于核酸修飾（磷酸骨架，堿基以及糖環(huán)的修飾）以及遞送介質(zhì)（脂質(zhì)體等）等相關(guān)技術(shù)的突破，使其成為繼小分子藥物、抗體蛋白質(zhì)藥物之后，出現(xiàn)的一類新模式藥物，是近年藥物開發(fā)的熱點(diǎn)之一。

寡核苷酸的結(jié)構(gòu)決定了它極性非常強(qiáng)，在常規(guī)的反相色譜柱上很難保留，可以使用HILIC模式、離子交換模式或者借助于離了對(duì)試劑在反相柱上實(shí)現(xiàn)保留，不同分離模式各自有自己的局限性。IP-RP作為其中常用的一種，應(yīng)用范圍較廣，今天我們從方法開發(fā)的角度一探究竟。

Part 1 方法初篩

不同離子對(duì)試劑的選擇對(duì)于物質(zhì)的保留差異較大。此次分析的樣品是20個(gè)堿基的寡核苷酸，優(yōu)先選擇TEA作為離子對(duì)試劑，后期因?yàn)樯婕斑M(jìn)質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn)，所以加入了100mmol的HFIP增加靈敏度。采用不同比例的有機(jī)相、結(jié)合不同濃度的緩沖鹽濃度，優(yōu)化色譜方法，得到24張色譜圖，疊加如下文圖1所示。

系統(tǒng): Nexera XS inert

色譜柱: Shim-pack Scepter Claris C18(100 mm x2.1 mm l.D.,3 um,P/N:227-31210-05)

溫度: 60°C

進(jìn)樣量:2 μL

流速: 0.4 mL/min

泵A

-Line A: 100 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液

- Line B:100 mmol/L HFIP水溶液

-Line C: 200 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液- Line D: 200 mmol/L HFIP水溶液

泵B

- Line A: 乙腈

- Line B: 甲醇

時(shí)間程序(%B):6%(0 min)>24 %(36 min)>50 %(36-37 min)>6%(37-46 min)

檢測(cè)器:260 nm(SPD-M40,UHPLC惰性流通池)

質(zhì)譜系統(tǒng):LCMS-2050

離子源: ESI/APCI(DUISTM),負(fù)模式

掃描模式: SCAN(m/z 500-2000)

霧化器: 2.0 L/min(N2)

干燥氣: 5.0 L/min(N2)加熱氣:7.0 L/min(N2)

DL溫度:200°C

溫度: 450°C

電壓:-2.0 kV

整體色譜柱峰形優(yōu)異，惰性化柱管對(duì)于因柱管導(dǎo)致的峰形拖尾等問題，改善明顯。

從②⑤⑧可以看出，隨著離子對(duì)試劑濃度的增加，保留提升，分離得到進(jìn)一步的改善。

HFIP濃度以及有機(jī)相的比例會(huì)影響基線，200mmol/L的HFIP中有100%純乙腈流動(dòng)相會(huì)引起基線的抬升，比如?, ?, ?和?的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)比結(jié)果⑧和結(jié)果?，可以看出HFIP的提升，對(duì)于分離展現(xiàn)出不同的效果。此外，在一些文章中也提到需要在流動(dòng)相中加入一定比例的HFIP，這樣使得TEA的溶解度變小， 因而TEA更容易綁縛在固定相上形成更穩(wěn)定的離子對(duì)試劑層 。這促使離子相互作用的分離機(jī)制非常顯著，尤其針對(duì)于硫代寡核苷酸。

從②③的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的有機(jī)試劑含量對(duì)于雜質(zhì)分離展現(xiàn)不同的選擇性。不同流動(dòng)相HFIP和TEA中的濃度、以及有機(jī)溶劑乙腈與甲醇的混合比例對(duì)FLP和FLP相關(guān)雜質(zhì)分離影響較大。

最終，通過矩陣設(shè)計(jì)，考察分離效果，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)條件⑤的分離效果佳，采用的流動(dòng)相條件為:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。

Part 2 方法優(yōu)化

參考以上分離結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化有機(jī)相混合比例、柱溫以及梯度條件。

發(fā)現(xiàn)40%甲醇-60%乙腈混合比例對(duì)于寡核苷酸的分離效果更優(yōu)。

文獻(xiàn)中提到升高的柱溫通常減小峰寬，從而一定程度上改善了雜質(zhì)分離，因此也是主要的一個(gè)影響因素。Scepter Claris C18色譜柱采用雜化硅膠，不僅具有雜化硅膠可以耐受高柱溫的特性，而且Scepter Claris色譜柱采用生物惰性涂層，相比于其他柱管的惰性化程度，惰性更優(yōu)，峰形改善更明顯。所以，進(jìn)一步優(yōu)化如圖3所示，柱溫65℃的峰展寬更弱，峰形更窄。

最后考察了洗脫的梯度，優(yōu)化梯度條件，確定優(yōu)的梯度檢測(cè)條件。

最終確定了檢測(cè)條件如圖5所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)從不同角度優(yōu)化方法，實(shí)現(xiàn)了n-1、PO等雜質(zhì)的良好分離。

同時(shí)，在寡核苷酸的分析檢測(cè)中，除了C18色譜柱應(yīng)用較多，C4色譜柱由于區(qū)別于C18的選擇性，應(yīng)用也非常多，常見于生物分析等。

采用島津Nexera XS inert 系統(tǒng)，配套島津全新惰性雜化硅膠色譜柱——Shim-pack Scepter Claris C18，從流動(dòng)相比例、梯度、柱溫等方面優(yōu)化方法，避免了不銹鋼柱管吸附導(dǎo)致的峰形問題，有效實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的分離分析。結(jié)合LabSolutions MD可實(shí)現(xiàn)整個(gè)工作流程優(yōu)化自動(dòng)化，包括生成分析進(jìn)度表、如自動(dòng)峰值跟蹤具體的數(shù)據(jù)處理功能、色譜的評(píng)價(jià)值和設(shè)計(jì)空間等，有效提升方法開發(fā)的效率。