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【摘要】 豐富的神經(jīng)示蹤技術(shù)極大的促進(jìn)了神經(jīng)解剖學(xué)的發(fā)展，為神經(jīng)生物學(xué)的各種研究提供了良好基礎(chǔ)，在此，我們概述了常用神經(jīng)示蹤劑及其示蹤特點(diǎn)，重點(diǎn)介紹了各種熒光染料和植物凝集素IB4的示蹤特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)示蹤劑;辣根過氧化物酶;熒光染料;植物凝集素IB4;病毒

Common characteristics of the neural tracers

　　Zhu He1,2, Li Li2, Zhao Lei2, Ma Ketao2, Si Junqiang2

　?。⊿hihezhi University, Shihezhi Xinjiang 832002）

自20世紀(jì)70年代初Kristenson將辣根過氧化物酶（HRP）應(yīng)用于追蹤神經(jīng)纖維以來，該方面的研究取得了的迅猛發(fā)展。此后，許多用途廣泛、敏感性強(qiáng)并能選擇性地進(jìn)行順行、逆行標(biāo)記或同時(shí)具有順、逆行標(biāo)記的追蹤物質(zhì)被應(yīng)用到神經(jīng)纖維的研究，對(duì)神經(jīng)解剖學(xué)的發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用?，F(xiàn)就常用的神經(jīng)示蹤劑及其示蹤特點(diǎn)綜述如下：

　　1辣根過氧化物酶

　　1.1辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP） HRP是一種含血紅素基的植物糖蛋白。HRP法是20世紀(jì)70年代發(fā)展并被廣泛應(yīng)用的一種神經(jīng)追蹤方法，但由于HRP顯影需要許多復(fù)雜的免疫組織化學(xué)技術(shù)，而且HRP參與細(xì)胞代謝，不能在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存留，易擴(kuò)散到鄰近組織造成神經(jīng)元的誤染，其反應(yīng)產(chǎn)物較不穩(wěn)定，易丟失，另外還存在“再攝取”現(xiàn)象[1]， 使得HRP在神經(jīng)逆行示蹤方面的應(yīng)用大大減少。

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　　1.2 霍亂毒素亞單位B結(jié)合的辣根過氧化物酶（CBHRP）R. N.Ranson等[2] 對(duì)傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶的染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用結(jié)合了霍亂毒素亞單位B的辣根過氧化物酶（CBHRP）作為示蹤劑，清晰顯示了神經(jīng)元的胞體和軸突結(jié)構(gòu)。近來也有采用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物替代傳統(tǒng)的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）來示蹤豚鼠的面神經(jīng)[3]的報(bào)道。TMB與DAB相比有不致癌和HRP反應(yīng)靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，步驟少，用時(shí)短及成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。

　　HRP法標(biāo)記的神經(jīng)元經(jīng)組織化學(xué)法處理后,細(xì)胞失去了活性,無法進(jìn)行膜片箝等神經(jīng)電生理的研究,限制了HRP法在這一領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。

　　2熒光染料

　　從上世紀(jì)50年代開始，熒光染料示蹤技術(shù)發(fā)展起來。它貯存穩(wěn)定，特別是組合采用不同的熒光染料分別標(biāo)記神經(jīng)元胞核和胞漿，可實(shí)現(xiàn)熒光雙標(biāo)或多重標(biāo)記，這是熒光素示蹤的一個(gè)zui大優(yōu)點(diǎn)。這種示蹤劑染色后只需使用熒光顯微鏡，便可觀察到已被標(biāo)記的神經(jīng)纖維或胞體。下面介紹幾種常用的熒光素。

　　2.1 固藍(lán)（Fast blue，F(xiàn)B）FB系水溶性染料，其顆粒較細(xì)密，易于被神經(jīng)軸索攝取，所以標(biāo)記神經(jīng)纖維或胞體多于其他染料，易于從標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到周圍組織，照射時(shí)褪色較快，即使保存在低溫、避光條件下，仍不能長(zhǎng)期保存。對(duì)需要標(biāo)記后較長(zhǎng)時(shí)間的觀察，或需分離培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究則不太理想。

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　　2.2 熒光金（Fluoro gold，F(xiàn)G）FG系脂溶性染料，能標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，它在紫外線（323nm）激發(fā)下發(fā)金黃色光（408nm），屬慢速軸漿運(yùn)輸類，細(xì)胞核不著色，能很好顯示樹突分支，細(xì)胞外無熒光染料滲漏，不易擴(kuò)散，與周圍組織分界清晰，褪色比較慢，可以經(jīng)受許多組織學(xué)染色處理，因而可以和HRP、免疫組織化學(xué)等方法結(jié)合。其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的存在不超過3周[4]。

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　　有學(xué)者將其用于視神經(jīng)的研究,標(biāo)記了視神經(jīng)纖維的分布路徑和走向[5]。Takayuki Nakajima等[6]采用熒光金結(jié)合SP、CGRP免疫熒光標(biāo)記反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大鼠L6DRG和S1DRG內(nèi)均存在大小不等的SP/CGRP雙標(biāo)記神經(jīng)元及中小型大小的FG/SP、FG/CGRP雙標(biāo)記陽性細(xì)胞和FG/SP/CGRP三標(biāo)記陽性細(xì)胞，這些標(biāo)記陽性細(xì)胞可能與包皮系帶損傷后陰莖自發(fā)性疼痛的產(chǎn)生和傳遞有關(guān)。

　　2.3 羰化青（1,1′ Dioctadecyl3,3,3′,3′ tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI） DiI是一種紫紅色晶體，具有高度的親脂性,在水中的溶解度很低，通常用乙醇溶解。它熒光強(qiáng)而穩(wěn)定,無毒性，不影響被標(biāo)記細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)，在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)消失慢、單純沿脂質(zhì)膜擴(kuò)散，有良好的軸突特異性，且對(duì)過路纖維影響小。在549nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm紅色熒光[7]。

　　1986年Honig[8]等報(bào)道DiI可作為熒光示蹤劑用于培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。DiI對(duì)試管內(nèi)動(dòng)物胚胎的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元沒有顯著的毒性作用，因而適用于活的組織、細(xì)胞的示蹤、標(biāo)記。但也有研究報(bào)道顯示DiI易于淬滅及易向神經(jīng)元胞體外擴(kuò)散的問題[9]?？偟膩碚f, DiI具有在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)、標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好、對(duì)活體細(xì)胞無毒性、在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)消失慢[10]、使用簡(jiǎn)便、染色速度快的特點(diǎn)。尤其是不影響被標(biāo)記細(xì)胞的電生理和生化特性使其越來越多的被用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究[11]。

　　2.4 熒光染料雙標(biāo)染色法 雙標(biāo)技術(shù)是通過不同示蹤劑對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞漿親和力不同，用兩種示蹤劑對(duì)不同的神經(jīng)纖維或靶器官進(jìn)行標(biāo)識(shí)。

　　2.4.1 固藍(lán)（Fast Blue） 和核黃（Nclear Yellow） 雙標(biāo)染色 Viterbo F等[12] 用固藍(lán)和核黃雙標(biāo)染色研究損傷后的脛神經(jīng)和腓神經(jīng)的側(cè)芽來源情況，對(duì)神經(jīng)纖維進(jìn)行了直接的形態(tài)學(xué)觀察。

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　　2.4.2固藍(lán)（Fast Blue）和雙脒基黃（Diamidino Yellow） 雙標(biāo)染色 雙脒基黃（Diamidino Yellow）熒光激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，經(jīng)神經(jīng)軸漿流的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)可達(dá)細(xì)胞核，細(xì)胞核呈綠色、黃綠色或黃白色。激發(fā)后熒光很強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞漿有時(shí)映出部分黃綠色或黃白色。C.T. Byers等[13]比較了固藍(lán)（Fast Blue）和雙脒基黃（Diamidino Yellow）逆行標(biāo)記神經(jīng)元的效力,研究結(jié)果顯示無論是單獨(dú)使用還是二者按任何次序聯(lián)合使用,被標(biāo)記的神經(jīng)元的數(shù)目是一致的。證明使用FB和DY進(jìn)行熒光雙標(biāo)的方法是可行的。相對(duì)于FB和其他的熒光染料組合形式,DY和FB的組合更為合理。DY能夠標(biāo)記細(xì)胞核的同時(shí)FB可以清晰的顯示細(xì)胞漿,在同一熒光顯微鏡下,二者可以清晰的顯示被標(biāo)記的細(xì)胞而充分互補(bǔ)。

　　2.4.3 臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue） 和雙脒基黃（Diamidino Yellow） 雙標(biāo)染色 臺(tái)盼藍(lán)熒光激發(fā)波長(zhǎng)為375 nm，經(jīng)神經(jīng)軸漿流的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)可達(dá)細(xì)胞漿，激發(fā)后細(xì)胞漿呈亮藍(lán)色。Yang等[14] 使用雙脒基黃和臺(tái)盼藍(lán)熒光雙標(biāo)研究切斷腓總神經(jīng)后行腓總神經(jīng)斷端和脛總神經(jīng)吻合的脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)現(xiàn),在相應(yīng)L4L6背根神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)脊髓腰膨大中分別存在雙脒基黃和臺(tái)盼藍(lán)雙標(biāo)的細(xì)胞，說明兩神經(jīng)之間有交叉支配的存在，表明神經(jīng)端側(cè)縫合后的再生方式是側(cè)枝芽生。

　　1991年Fritzsch和Sonntag[15]比較研究了熒光素和生物素葡糖聚胺的標(biāo)記效力，隨后Harsh[16]等在1991年又比較了FG素和DiI兩者之間的標(biāo)記效能。1993年，Brushart等人又分別比較研究了熒光素和HRP之間的標(biāo)記效能。這幾種示蹤劑的組合的弊端是在同一顯微鏡下不能被同時(shí)觀察到。更重要的是，生物素葡糖聚胺和DiI通常情況下不被未損傷神經(jīng)攝取的特性決定使用兩者作為標(biāo)記物時(shí)必須先切斷或損傷被標(biāo)記神經(jīng)。常用的幾種熒光染料中，TB和FB能夠標(biāo)記細(xì)胞漿，NY和DY能夠特異的結(jié)合被標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核。

　由于熒光素分子量小，用于逆行追蹤的共同問題是易于擴(kuò)散，比HRP法更難于確定有效注射部位。與HRP法相似，熒光素示蹤法也存在過路纖維攝入問題。褪色是熒光素的一大缺點(diǎn)，在激發(fā)光照射下較快褪色，因此允許觀察的時(shí)間短。即使在低溫、避光條件下，切片保存時(shí)間仍有限，不能長(zhǎng)期保存。

　　3 生物素葡糖聚胺（Biotindextran amine, BDA）

　　BDA應(yīng)用于軸漿運(yùn)輸?shù)母鞣N示蹤劑，常用來研究神經(jīng)元的分支投射，但很少有直接用于觀察周圍神經(jīng)局部軸突的研究。BDA具有保存時(shí)間長(zhǎng)，并可與多種熒光追蹤劑及各種免疫組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)[17]，能滿足光鏡及電鏡下觀察的要求。相對(duì)于HRP與熒光素示蹤劑，經(jīng)處理的BDA標(biāo)記組織標(biāo)本可以保存6個(gè)月以上，不影響zui終顯影結(jié)果。

　　4病毒

　　常用在神經(jīng)通路示蹤方面的兩類病毒是腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴隨病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）和皰疹病毒。

　　腺病毒和腺病毒伴隨病毒在神經(jīng)示蹤中的應(yīng)用得益于綠色熒光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）基因的發(fā)現(xiàn)。日本科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健正是因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出的重大貢獻(xiàn)摘取了2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

　　GFP來源于維多利亞水母（AequoreaVictoria）,其熒光發(fā)射峰在509nm，zui大激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，并在470 nm處有1個(gè)肩峰[18]，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定[19]。熒光蛋白的顯著優(yōu)點(diǎn)是與生物相容性好，標(biāo)記生物分子后不影響其生物活性，發(fā)光強(qiáng)度高，易于識(shí)別與檢測(cè)。但是，目前熒光蛋白種類還比較少，而且大部分都是從生物體中提取，較難大批量生產(chǎn)[20] 。

　　4.1腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴隨病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）構(gòu)建表達(dá)GFP的腺病毒和rAAV載體，用于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)通路的示蹤，具有*的優(yōu)點(diǎn)。GFP產(chǎn)生的熒光可以耐受光漂白和福爾馬林的固定，能夠制成長(zhǎng)期保存的標(biāo)本[21]，可用于不同神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)分析和纖維的研究，尤其適用于某些特定功能的局部神經(jīng)環(huán)路的研究。

　　但是注入GFP 基因重組病毒的多少將影響GFP熒光的強(qiáng)弱。如果注入重組病毒過少時(shí)，熒光淺淡而不易觀察，如果注入的GFP基因重組病毒較多，它在標(biāo)記神經(jīng)元及突起的同時(shí)，會(huì)增多對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，產(chǎn)生干擾[22]。

　　4.2 皰疹病毒（Herper virus）皰疹病毒的主要特點(diǎn)是親神經(jīng)性和跨神經(jīng)元傳遞。皰疹病毒是具有復(fù)制能力的病毒，作為神經(jīng)通路的示蹤劑,它能夠?qū)κ聚櫺盘?hào)進(jìn)行放大，增加了示蹤的靈敏度。在應(yīng)用皰疹病毒作為神經(jīng)示蹤劑時(shí)，對(duì)病毒毒株的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗具有重要的意義。

　　5植物凝集素IB4

　　凝集素（Lectins）是一類從各種植物種子和動(dòng)物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。凝集素zui大的特點(diǎn)是能識(shí)別細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。

　　作為初級(jí)傷害性感受器的小直徑感覺神經(jīng)元根據(jù)和IB4結(jié)合能力的不同可以分為植物凝集素陽性的非肽能神經(jīng)元和植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元，前者呈膠質(zhì)源性營(yíng)養(yǎng)因子依賴性，而后者則呈神經(jīng)生長(zhǎng)因子依賴性[23]。植物凝集素陽性的非肽能神經(jīng)元的動(dòng)作電位相對(duì)于植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元而言，其持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、具有更高密度的河豚毒素不敏感的鈉電流以及更小的熱傷害刺激電流[24]。Belyantseva等[25]發(fā)現(xiàn)在遭受慢性損傷后，植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元會(huì)大量的增生。

　　綜上所述，辣根過氧化物酶zui早應(yīng)用于神經(jīng)的逆行示蹤，但由于使用方法較復(fù)雜且穩(wěn)定性差、易擴(kuò)散，限制了它的應(yīng)用;熒光示蹤劑使用方法簡(jiǎn)便易行、易觀察，但存在熒光淬滅現(xiàn)象，僅適用于短期觀察，而生物素葡聚糖胺則不存在這種現(xiàn)象，其結(jié)果可以保存較長(zhǎng)時(shí)間;其他毒素或病毒鰲合物能良好地顯示神經(jīng)元鏈或網(wǎng)絡(luò)，但目前在神經(jīng)示蹤方面應(yīng)用較少;物凝集素IB4能特異地和脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)與傷害性刺激相關(guān)的小型神經(jīng)元結(jié)合，為脊髓背根神經(jīng)節(jié)痛覺相關(guān)小直徑細(xì)胞的研究提供了極大的方便。

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