說到色譜，積分可是大事，今天我們就講講積分的故事…

在我們要對色譜峰進行積分計算之前，得先了解幾個概念：

定義

1、積分

指在信號中確定峰并計算其大小，積分包括以下操作及步驟：識別、校正、定量。

2、積分事件的參數(shù)控制

對于某個信號進行積分時，軟件將識別每個峰的開始和結(jié)束時間，并用豎線標記這些點，尋找每個峰的峰頂點，確定保留時間/遷移時間，建立基線，以及計算每個峰的峰面積、峰高和峰寬。這些過程積分事件的參數(shù)控制。

3、自動積分

自動積分功能為設(shè)置初始事件提供開始點。自動積分功能設(shè)置以下參數(shù)：初始斜率靈敏度（閾值）、初始峰高、初始峰寬、初始小峰面積。

4、手動積分

此類型的積分允許對選定的峰或峰組進行積分，在的手動積分范圍內(nèi)，將忽略此軟件的事件積分（初始小峰面積除外）。如果手動積分出來的一個或多個峰低于小峰面積閾值，則此積分將被廢棄。手動積分時間使用時間值。它們不會為信號漂移作調(diào)整。

在報告中，手動積分提供以下功能：

§ 劃基線：為一個峰或一組峰劃基線的位置；

§ 負峰：何時將基線以下的面積當(dāng)作負峰處理；

§ 切線撇去：計算從主峰切線撇去的峰面積；

§ 分裂峰：用垂線分裂峰的點；

§刪除峰：從積分結(jié)果中刪除一個或多個峰。

積分參數(shù)

自動積分主要是修改以下4個積分參數(shù)實現(xiàn)的，具體如下：

1、斜率靈敏度（Slope Sensitivity）

也稱閾值，指設(shè)置信號斜率的值，該斜率用于識別積分過程中峰的起點和終點。如何信號斜率大于“斜率靈敏度”值，將建立峰起點，如果信號斜率降到“斜率靈敏度”以下，將建立峰止點。

設(shè)置值越低，峰響應(yīng)越靈敏，當(dāng)然，不同品牌的儀器對設(shè)置值的響應(yīng)程度會有所區(qū)別。

2、峰寬值（Peak Width）

用于控制積分器的選擇性以區(qū)分峰與基線噪音。如果設(shè)置的初始峰寬太小，則可能將噪音當(dāng)作峰。如果寬峰與窄峰混在一起，可以選用運行時間編程事件設(shè)定特定的峰寬。

3、小峰面積值（Area Reject）

根據(jù)峰面積來設(shè)置小于目標峰面積的峰將不被積分也不會報告；

4、小峰高（Height Reject）

小目標峰的高度，任何小于小峰高的峰將不被積分及報告。

了解完概念，咱們說說如何進行積分計算？首先看一張圖：我在峰底下畫根線，這個線就是告訴軟件那個部分需要計入峰面積的計算。

我們說過，美圖軟件簡單好用容易上手，所以，大部分時候，我們的美圖軟件能自動幫我們畫線。

這就是說，我們的軟件能夠比較準確的指認出色譜峰，但是有些時候，軟件會犯傻，出現(xiàn)一些神作…

各位可能不知道，去韓國整容，大夫是要要先打草稿的，這一條條的線，就是草稿，草稿打的好，以后效果才好，所以，別小看這一堆線，這是成功的關(guān)鍵。

計算的效果如何，就全看這根線畫得準不準了，那么，這個線到底該怎么畫…

積分計算

首先，我們得知道到底怎么把一個“峰”認為是一個峰：

其實軟件看判斷峰是不是峰是有“套路”的，有一些指標的。靠一些數(shù)字閾值來確認的。各家軟件里一定都有，而且對各個參數(shù)的指認也有不同的算法和單位，都說出來太亂，而且估計大家也懶的看，總結(jié)了一下，軟件看峰的標準就是：

太陡了不積，太緩了也不積

太小了不積，太大了也不積

太矮了不積，太高了也不積

太胖了不積，太瘦了也不積

不讓積的時候，堅決不積

知道了這些套路，還怕啥子積分，當(dāng)然，這還有什么其他用呢？

如果峰長得太丑，會不會給積分呢？當(dāng)然不會，軟件不認啊，當(dāng)然也不給積分了。

那如果，長得特別丑的峰被積分了，怎么辦？嘿嘿，你懂的，暗箱操作，改規(guī)矩唄...

修改規(guī)則這個事兒，在咱們的軟件里，叫做調(diào)整積分參數(shù)，目的就是讓咱們把那根線劃得剛剛好，讓想積分的峰積分上，這是一個很有技巧的事情，尤其是對于一些長相奇葩的峰，這條線怎么劃，就更是有學(xué)問了。對于這樣不太合格的峰，如果我們能調(diào)節(jié)參數(shù)讓積分線盡量能吧這些峰畫出來，那也就能勉強擠入選擇范圍了，這種修改積分規(guī)格的情況叫做，手動干預(yù)，當(dāng)然，軟件越，劃線的手法也越厲害，比如上面的圖和下面的圖其實都是同一種情況，但是軟件如果厲害點，就會把直的積分線掰彎，讓面積計算更準點。

但可是，很多時候，我們不管怎么調(diào)，都找不出一個合適的組合將特別丑的峰積分，這個時候，該怎么辦？這個時候，我們就該用更深的套路了，那個特別丑的峰必須積分…強行在那個特別丑的峰上劃條線…這個行為，叫做“手動積分”，這是積分界的大殺器，它說積誰就積誰，就是這么霸氣。

雖然霸氣，但是麻煩也很多…尤其在法規(guī)實驗室這種監(jiān)管森嚴的地界，一旦出現(xiàn)修改規(guī)則的事兒，要是沒有能讓人信服的理由，那事情可就鬧大了。

而管這個事的就是大名鼎鼎的FDA。

積分步驟

在軟件自動積分完成以后，如果根據(jù)我們數(shù)據(jù)處理方法中預(yù)設(shè)的積分參數(shù)得到的計算機過一切正常的話，皆大歡喜，分析完成出報告

如果，你發(fā)現(xiàn)了一點小問題，比如有些峰沒有被正確的積分出來，這個時候，我們就要走到第二個十字路口了，這些峰，到底是積還是不積…

到底該走哪邊，主要還是看峰沒有被正確積分的原因，

由于分離度或靈敏度低導(dǎo)致的峰沒有正確指認，

基線漂移導(dǎo)致的誤判，

保留時間微小變化導(dǎo)致的誤判，

峰型變化比如拖尾導(dǎo)致的誤判等。。。

當(dāng)然，這些都是可能原因之一，具體什么原因，這需要各位根據(jù)自己實驗室的要求和方法的具體情況具體判斷，但是，有些情況是禁止的：

那就是好好的一個峰，但是非要亂劃線以使它能夠滿足系統(tǒng)適應(yīng)性或者測試結(jié)果標準要求的情況。基本我們的數(shù)據(jù)的命運就決定了，被淘汰的，就要啟動實驗室調(diào)查了，而有些峰，還有一次機會被重新審查，進入手動積分階段，不過，到底是小改干預(yù)一下，還是要玩大的顛覆規(guī)則，那就要看峰自己的造化了

如果峰的毛病不大，只是暫時發(fā)揮失常，我們只要稍微調(diào)整下積分參數(shù)的設(shè)置就可以讓他們重回正常的積分狀態(tài)，那我們只需進行手動干預(yù)就可以

比如由于保留保留時間微小漂移的峰，我們可以適當(dāng)調(diào)整時間窗口，或者是由于靈敏度問題的峰，我們可以適當(dāng)調(diào)整峰高接受的閾值，他們就可以被正確積分。

但是有些峰，走型比較嚴重，比如比較嚴重的拖尾或者基線漂移，實在是超出了軟件自己解決問題的能力，那這個時候，我們只能親自操刀來劃那條線了，這個事情很重要，必須要親歷親為，小心謹慎。

這遍套路，聽著講下來，好像挺流暢，不過，好腦子不如爛筆頭，在實驗室里，一定要把套路記錄下來，形成自己門派的獨門秘籍，這個獨門秘籍，就是SOP，關(guān)于手動積分，如何判斷，如何使用，自己的實驗室里一定要結(jié)合自己的標準和情況制定一個SOP，這個SOP里一定要說明：

重新積分的原因，這是針對個十字路口的

允許重新積分的情況，這是針對第二個十字路口的，任何不滿足的這些情況的數(shù)據(jù)，不應(yīng)該重新積分，而應(yīng)該啟動實驗室調(diào)查。

重新積分使用的原理和方法

SOP猶如武功秘籍，不過接下來，要想練功，使用這個SOP，還得遵守一些江湖規(guī)矩：

重新積分的操作要經(jīng)過相關(guān)權(quán)限人員管理者授權(quán)后才能進行，并且需要具有相應(yīng)權(quán)限的人員進行操作，所以，進行手動積分操刀的，一定得是行家。

所有偏離SOP的偏差都應(yīng)該在分析報告中討論，這叫亡羊補牢，避免下次走上同一條不歸路。

色譜積分參數(shù)和重新積分的情況，初始和終積分數(shù)據(jù)都應(yīng)該在實驗室進行記錄并且經(jīng)過復(fù)核，歸檔保存，這是為了留下證據(jù)，防止以后死無對證。

這么一看，要想搞定手動積分，還真是要花上不少心思，所以，建議就是：

與其潛心鉆研怎么搞好手動積分，寫好SOP，遵守規(guī)章制度，不如當(dāng)初把方法做好一點，把可能分不好的峰都分開，峰型不好的給調(diào)好，選好合適的梯度和檢測波長減小基線漂移等等，這樣可以達到一勞永逸的效果。