手性色譜柱的分類和原理

手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通過(guò)引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的。要實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級(jí)-偶級(jí)作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。手性分離效果是多種相互作用共同作用的結(jié)果。這些相互作用通過(guò)影響包埋復(fù)合物的形成，特殊位點(diǎn)與分析物的鍵合等而改變手性分離結(jié)果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細(xì)調(diào)節(jié)、優(yōu)化流動(dòng)相和溫度以達(dá)到*分離效果?！≡谑中圆鸱种?，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識(shí)別能力，但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過(guò)程中要考慮柱溫的影響，確定*柱溫。迄今為止，尚沒(méi)有一種類似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體不得不采用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價(jià)格昂貴，因此如何根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)選擇適用的是非常重要的。

根據(jù)手性固定相和溶劑的相互作用機(jī)制，可提出的分類體系：

第1類：通過(guò)氫鍵、π-π作用、偶級(jí)-偶級(jí)作用形成復(fù)合物。

第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋復(fù)合物。此類中典型的是由纖維素及其衍生物制成的。

第3類：基于溶劑進(jìn)入手性空穴形成包埋復(fù)合物。這類中zui典型的是環(huán)糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的也屬于此類。

第4類：基于形成非對(duì)映體的金屬絡(luò)合物，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。

第5類：蛋白質(zhì)型。手性分離是基于疏水相互作用和極性相互作用實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)固定相的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將分為以下幾種：

●　刷（Brush）型或稱為Prikle型

●　纖維素（Cellulose）型

●　環(huán)糊精（Cyclodextrin）型

●　大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiotics）型

●　蛋白質(zhì)（Protein）型

●　配位交換（|Ligand exchange）型

●　冠醚（Crown ethers）型

1 刷型：應(yīng)用范圍較廣、柱效很好的。

刷型是根據(jù)三點(diǎn)識(shí)別模式設(shè)計(jì)的，刷型手性固定相分為 π 電子接受型和 π 電子提供型兩類。

zui常見(jiàn)的 π 電子接受型固定相是由（ R ） -N-3 ， 5- 二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到 γ- 氨丙基硅膠上的制成。此類刷型可以分離許多可提供 π 電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對(duì)化合物進(jìn)行衍生化后進(jìn)行手性分離。 π 電子供給型固定相常見(jiàn)的是共價(jià)結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有 π 電子接受基團(tuán)，例如二硝基苯甲?；?。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進(jìn)行衍生化后，用 π 電子供給型固定相達(dá)到手性分離。

刷型固定相的優(yōu)勢(shì)在于其易于合成。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在于它僅對(duì)芳香族化合物有效，有時(shí)不得不進(jìn)行衍生化反應(yīng)。這種衍生化反應(yīng)是非手性衍生反應(yīng)，所以不存在手性衍生的問(wèn)題。刷型手性色譜使用的流動(dòng)相基本是極性弱的有機(jī)溶劑，這對(duì)于制備色譜來(lái)講未必是缺點(diǎn)。

近來(lái)，刷型固定相出現(xiàn)了 π 電子供給和接受基因的混合固定相。十分適用于 β- 阻斷劑的手性分離。典型的流動(dòng)相為二氯甲烷 - 乙醇 - 甲醇混合物，比例為 85 ： 10 ： 5 。加入 10mM 醋酸銨可以調(diào)整保留時(shí)間。同時(shí)具有 π 電子供體區(qū)和受體區(qū)，形成手性裂縫，因此對(duì)于某些分子具有很高選擇性。

2 纖維素型： 
　　纖維素型的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復(fù)合物。它們屬于分類中的第 2 種類型。市售的為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過(guò)此類型的色譜柱得到分離。這種類型的種類也很齊全。流動(dòng)相使用低極性溶劑，典型的流動(dòng)相為乙醇 - 己烷混合物。但特別要注意由于氯可以使纖維素從硅膠上脫落，因此要確保流動(dòng)相中無(wú)含氯溶劑。 
　　這種類型的主要的制造商之一是日本的 Daicel 公司，他們生產(chǎn)的纖維素酯和氨基甲酸纖維素柱可以分離多種生物堿和藥物。特別值得一提的是 OD 柱。在某手性化合物異構(gòu)體的分離中，分離度超過(guò)了 25 ，這意味著載樣量可以很高，對(duì)于制備十分有利。纖維素固定相的每個(gè)單元都為螺旋型，而且這種螺旋結(jié)構(gòu)還存在極性作用、 π-π 作用及形成包埋復(fù)合物等手性分離因素。淀粉代替纖維素制成的此類手性柱顯示了和纖維素柱不同的選擇性，但是穩(wěn)定性較差。因?yàn)榈矸凼撬苄缘?，因此流?dòng)相中必須無(wú)水才能保證柱子壽命。目前此類型的柱子能分離 80% 左右可能面臨到的所有手性化合物。此類柱子通常用于正相系統(tǒng)，用正己烷 - 乙醇，正己烷 - 異丙醇混合溶劑為流動(dòng)相。 OD 柱也可用于反相的情況，但流動(dòng)相必須含有高濃度的高氯酸鹽緩沖液，以防止固定相溶解。即使這樣，使用較長(zhǎng)時(shí)間以后色譜柱也難免要受到損害，但是在某些情況下使用反相系統(tǒng)分離效果要優(yōu)于使用正相系統(tǒng)。