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凍干過(guò)程的分析與觀察

Hsu等將重組CD4-IgG(CD4-免疫球蛋白G)用四級(jí)串聯(lián)的帕耳帖組件冷卻至-60℃，用一架低溫顯微鏡觀察到了它的再結(jié)晶過(guò)程。他的觀察室也可以被抽成真空而用于冷凍干燥研究。

圖4-17中，(a)是快速冷卻過(guò)程中，約在-24℃時(shí)樣品的照片，(b)是第一次從-54℃加熱到約-36℃的照片，(c)是再次被冷卻到-54℃時(shí)的照片。在圖(a)中，大部分晶體（顏色較深處）均勻地分布在濃縮的非晶固體（顏色較亮處）中間。在圖(b)中，晶體有所生長(zhǎng)，濃縮物中的水分也已經(jīng)結(jié)晶。在圖（c）中，晶體與玻璃狀雜質(zhì)的邊界清晰可見(jiàn)，特別是在圖中右上角更明顯。圖4-18所示的是在一些具有可比性的溫度下，樣品另外的一個(gè)部分，即靠近樣品邊界的顯微照片：(a)約在-23℃，(b)第一次加熱時(shí)，約在-30℃，(c)再次冷卻到-60℃。圖(b)中，晶體已有所生長(zhǎng)，但其大致結(jié)構(gòu)沒(méi)有太大的變化，特別是在圖的左上角部分。在圖(c)中，晶體與玻璃狀物質(zhì)的邊界更加清晰。圖4-18所示的是樣品的第三部分：(a)冷卻到一65℃之后的照片，(b)熱處理后，再次冷卻到-60℃，然后在-40℃開(kāi)始凍干。同樣，熱處理并未使整體結(jié)構(gòu)有所改變，但是晶體結(jié)構(gòu)更加清晰，這表明玻璃相和晶體之間的水分子已經(jīng)遷移到晶體中。圖4-17~圖4-19中的照片說(shuō)明，快速冷卻不能使整個(gè)樣品的各個(gè)部分形成均勻的組織結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼤?huì)受到邊界效應(yīng)的影響。但是，在樣品的所有部分都觀察到了熱處理的影響。圖4-20所示的是，從冷卻結(jié)束溫度（-60℃)上升到開(kāi)始干燥溫度（-42℃）時(shí)，不經(jīng)熱處理對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響。值得注意的是，在自動(dòng)向低溫?cái)R板上裝載產(chǎn)品時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。第一次裝載藥瓶中的產(chǎn)品與后來(lái)裝載的，例如2~3h后裝載的，產(chǎn)品有不同的結(jié)構(gòu)。

低溫顯微鏡研究的優(yōu)點(diǎn)是有可以顯示樣品組織結(jié)構(gòu)變化過(guò)程的照片，而且，凍結(jié)的產(chǎn)品可以在大多數(shù)的設(shè)備中被冷凍干燥。產(chǎn)品層很薄，因此可以被迅速冷凍。所以，產(chǎn)品在復(fù)溫和干燥過(guò)程中所表現(xiàn)出的性狀特征與快速冷凍過(guò)程的相一致。因?yàn)楫a(chǎn)品層很薄，故模擬熱處理的過(guò)程很困難。然而，實(shí)驗(yàn)表明，從此項(xiàng)研究中獲得的臨界溫度是有價(jià)值的，特別是獲得冷凍速率相對(duì)緩慢時(shí)產(chǎn)品的電阻值。

Nunnerf使用一臺(tái)特殊的低溫顯微鏡拍攝到了0.9%的NaCl溶液在360s內(nèi)直接冷凍到穩(wěn)定樹(shù)枝狀冰晶結(jié)構(gòu)的過(guò)程中冰晶邊界面變化的照片（如圖421）。在冰晶的表面可見(jiàn)因濃縮而集中起來(lái)的NaCI(黑色邊界)。

Cosman等人描述了一臺(tái)可以定量評(píng)價(jià)照片的低溫顯微鏡，該裝置有如下四個(gè)顯著特點(diǎn)：

①溫度的產(chǎn)生、測(cè)量和控制是由程序控制的;

②顯微照片可以存檔，以備后用；

③文檔可部分地用于自動(dòng)圖像識(shí)別;

④如果冷凍過(guò)程可以用數(shù)學(xué)的方法描述，而且細(xì)胞的行為可以預(yù)測(cè)，則用上述方法可以減少數(shù)據(jù)量。

圖4-22表示的低溫顯微鏡系統(tǒng)的布置圖。通過(guò)使用熱傳導(dǎo)性非常優(yōu)良的藍(lán)寶石觀察窗和使用液氮冷卻系統(tǒng)，作者實(shí)現(xiàn)了以每分鐘冷卻速率冷卻到一60℃，而且在溫度為0℃時(shí)，樣品內(nèi)的溫度梯度達(dá)到了0.1℃/mm。

下面用三個(gè)例子來(lái)說(shuō)明使用這種顯微鏡系統(tǒng)如何進(jìn)行冷凍過(guò)程的定量研究和存檔。圖4-23表示的是被分離的老鼠胰島細(xì)胞的體積與溫度的函數(shù)關(guān)系曲線(xiàn)。如圖4-24所示，細(xì)胞膜對(duì)水和CPA的滲透性的不同對(duì)細(xì)胞的冷凍是非常重要的。

將獼猴卵母細(xì)胞置入體積分?jǐn)?shù)10%的二甲基亞砜溶液(DMSO)后其體積幾乎減少到原來(lái)的三分之一，這是因?yàn)樗軓募?xì)胞里擴(kuò)散到周?chē)h(huán)境中去，而二甲基亞砜卻不能擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)（測(cè)量溫度為23℃）。

細(xì)胞損壞的原因在于細(xì)胞內(nèi)冰晶成核。圖4-25表示在不同冷卻速率下，有多少老鼠卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰與溫度之間的函數(shù)關(guān)系曲線(xiàn)。老鼠肝細(xì)胞在以大約40℃/min的速率冷卻到-21℃的過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰，然而，當(dāng)以140℃/min速率冷卻時(shí)幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都存在冰，這是因?yàn)樗疀](méi)有足夠的時(shí)間擴(kuò)散到周?chē)h(huán)境就被凍結(jié)在細(xì)胞內(nèi)。圖4-25也說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)冰晶成核是由絕對(duì)溫度和冷卻速率決定的：在大約-25℃，以5℃/min速率冷卻幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都有冰，然而，以3.5℃/min速率冷卻，大約20%的細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有冰。

Dawson和Hockley利用掃描電子顯微鏡(SEM)表明了海藻糖和甘露醇溶液的快速冷凍(150℃/min)和慢速冷凍(1℃/min)時(shí)結(jié)構(gòu)上的差異。圖4-26表示1%海藻糖溶液被(a)慢速和(b)快速冷凍時(shí)中心部位的表面結(jié)構(gòu)。慢速冷凍樣品（c）濃縮的固體表面上產(chǎn)生裂縫，然而，快速冷凍的樣品的結(jié)構(gòu)卻是均勻的纖維狀。圖4-27表示慢速和快速冷凍1%乳糖時(shí)其中心部位粗糙的(a)和精細(xì)的(b)結(jié)構(gòu)。在圖4-28(a)中可發(fā)現(xiàn)海藻糖溶流崩塌的部分，圖（b)表示干燥后產(chǎn)品在潮濕的環(huán)境下貯存6個(gè)月以后的結(jié)構(gòu)，圖片表明不同的冷凍速率導(dǎo)致不同的結(jié)構(gòu)，且有可能使固體濃縮在表面上，在干操過(guò)程使干燥速率降低，殘余水分含量增加。