一、前言：

過去20年來，拉曼光譜法在制藥應(yīng)用中取得了長足的發(fā)展。晶型分析是拉曼在分析實驗室的藥物分析中提供的一項功能，以及用于顆粒、基質(zhì)和表面分析的拉曼光譜共聚焦顯微鏡功能。

從2010年代末開始，手持式拉曼系統(tǒng)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用激增。這些儀器配置了專用操作系統(tǒng)，用于GMP環(huán)境中的輔料和API定性分析、固體劑型確認和防偽分析，現(xiàn)在已成為事實上的高效GMP原材料來料檢測標準。

生物過程監(jiān)測是光譜平臺非常適用的領(lǐng)域。早在20世紀90年代末，近紅外和中紅外光譜系統(tǒng)就已被研究用于生物過程代謝物監(jiān)測應(yīng)用，但水對紅外光譜的吸收嚴重限制了可用于吸收測量的光程，從而導致檢測背景噪音過大。拉曼光譜受益于相對較弱的水散射截面，因此從本世紀初開始研究拉曼光譜的這種應(yīng)用也就不足為奇了。拉曼技術(shù)在光學采樣表面也提供了相當大的靈活性，無論使用塑料、玻璃和其他礦物質(zhì)作為采樣接觸表面的干擾都非常小。

早期拉曼生物過程工作的重點領(lǐng)域是各種生物系統(tǒng)中的細胞代謝物，并且隨著人們的興趣迅速擴大，這種應(yīng)用仍在繼續(xù)。許多研究者還發(fā)表了關(guān)于評估關(guān)鍵產(chǎn)品質(zhì)量屬性的可能性文獻，如蛋白質(zhì)翻譯后修飾和聚合等的相關(guān)研究。

根據(jù)Google Scholar的 數(shù)據(jù)，過去10年，與“Raman+ BioProcess"相關(guān)的引用呈指數(shù)級增長（圖1），到2023年，引用次數(shù)將超過4000次。

二、傳統(tǒng)經(jīng)驗?zāi)Ｐ?/span>的挑戰(zhàn)：

 復(fù)雜生物系統(tǒng)中拉曼數(shù)據(jù)的分析需要計算輔助。正如Ryder所評論的那樣，在這項工作中可以采用多種化學計量學和多變量工具。關(guān)于關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CPP 和   CQA）的建模，絕大多數(shù)文獻中采用偏最小二乘  (PLS)  回歸。PLS  是一大類潛變量/正則化經(jīng)驗線性校準方法之一。它在化學應(yīng)用中占據(jù)明顯主導地位的原因很大程度上是歷史和商業(yè)原因，但它相比于其他方法并沒有更好的表現(xiàn)。不過所有經(jīng)驗方法確實都有一個優(yōu)點，即幾乎不需要詳細了解底層細胞培養(yǎng)環(huán)境、分析儀器的物理化學原理。

但是，使用這些經(jīng)驗校準方法對生物過程數(shù)據(jù)進行建模存在一些重大挑戰(zhàn)，如下所示：

1, 非平穩(wěn)性(Nonstationarity)和方差齊性(Homoscedastivity)：在數(shù)學和統(tǒng)計學中，“平穩(wěn)性"是一個術(shù)語，意味著每個數(shù)據(jù)（在本研究中為光譜數(shù)據(jù)）都是從具有固定分布特性的隨機分布中得出的。大多數(shù)商業(yè)軟件中的 P LS  等經(jīng)驗方法僅在理論上是準確的，并且是使用“平穩(wěn)"數(shù)據(jù)進行優(yōu)化的。這意味著每個生物反應(yīng)過程必須以相同的方式運行，并且化學物質(zhì)之間具有一致的相關(guān)性。它還意味著儀器中的測量方差在時間和通道上始終相同（方差齊性）。對于拉曼光譜（或近紅外或中紅外光譜吸收）來說，情況并非如此，特別是在生物過程中，當大量生物量(Biomass)可能導致生物反應(yīng)過程運行中或不同批次之間的熒光差異非常大時，從而導致數(shù)據(jù)噪音波動顯現(xiàn)數(shù)量級的差異。

2, 協(xié)變量：根據(jù)定義，在生物反應(yīng)過程中許多物質(zhì)之間存在時間相關(guān)性。廣泛使用的經(jīng)驗方法旨在利用這些經(jīng)驗時間相關(guān)性；但這些關(guān)聯(lián)方法非常容易產(chǎn)生非特異性關(guān)聯(lián)，從而降低預(yù)測準確性和通用性。

3, 可交換性和交叉驗證：與上述兩點相關(guān)，交叉驗證通常作為數(shù)據(jù)建模工作中經(jīng)驗?zāi)Ｐ偷臏黍炞C評估來完成。為了使交叉驗證結(jié)果有效且具有代表性，數(shù)據(jù)必須是“可交換的"；但由于協(xié)變量的原因，生物過程數(shù)據(jù)通常嚴重違反了這一原則。

4, 試錯法：這些經(jīng)驗方法中的大多數(shù)都包括變量選擇、預(yù)處理、歸一化和校正方法的一系列選項。推薦的方法是“嘗試一下，看看什么似乎有效"，因為通常沒有什么理論依據(jù)來指導選擇這種方法而不是另一種方法。

5, 質(zhì)量因數(shù)：與上述內(nèi)容相關(guān)，大多數(shù)商業(yè)軟件中報告的主要指標是“RMSEC/RMSECV/RMSEP"：[校準/交叉驗證/預(yù)測]的均方根誤差]。藥典分析標準通常期望對選擇性、線性、精密度、檢測限和靈敏度進行估計；但不幸的是，經(jīng)驗建模方法不能直接估計這些質(zhì)量因數(shù)。用戶可以進行實驗工作來評估這些值，但這是相當具有挑戰(zhàn)性的，通常需要定制化的編程/分析。

6, 光譜儀變化：當開發(fā)經(jīng)驗?zāi)Ｐ蜁r，單個光譜儀的個體特性和非理想效應(yīng)也會成為開發(fā)者的協(xié)變量。當更換光譜儀或更換激光器/探測器時，經(jīng)常需要校正多變量模型以確保與新光譜儀的個體相關(guān)性。經(jīng)常需要使用多種數(shù)學方法來執(zhí)行這種“校準遷移"。

7, 監(jiān)管挑戰(zhàn)：經(jīng)驗建模方法的?箱性質(zhì)需要廣泛的經(jīng)驗驗證工作來證明其靈敏度、選擇性、線性和穩(wěn)定性。監(jiān)管指導文件（如ICH Q 14 10.3）中提供了一些通用指南，但它們并不是特別明確，也不是以這些方法的數(shù)學基礎(chǔ)為理論依據(jù)。

考慮到這些挑戰(zhàn)，毫無疑問，穩(wěn)健的拉曼方法開發(fā)和部署一直是生物反應(yīng)過程應(yīng)用中特別棘手的挑戰(zhàn)。人們已經(jīng)做出了許多努力來克服其中的一些障礙。設(shè)計故意擾動實驗可用于試圖“打破"本質(zhì)上存在的協(xié)變量并擴大可用于建模的經(jīng)驗數(shù)據(jù)的范圍。

不同文獻報告了使用  PLS 和 各種預(yù)處理方法成功構(gòu)建“通用"模型，并報告在特定平臺方法的合理成功；但這些工作通常涉及  25?30  次以上的生物反應(yīng)實驗，需要花費大量的時間和人力物力；并且還不包括隨后的實驗部署和維護成本。這些文獻結(jié)果與行業(yè)研討會報告的內(nèi)容思路基本一致。 

三、Maverick的全新模型：

我們的目標是改善將拉曼光譜方法引入生物反應(yīng)過程監(jiān)測的技術(shù)挑戰(zhàn)。我們從哺乳動物 C HO  和  HEK293  細胞系開始，這些細胞系廣泛用于蛋白質(zhì)(單抗)和病毒載體的生產(chǎn)，并且可用于放大生產(chǎn)。

僅憑借純粹的經(jīng)驗建模/校準很難規(guī)避上述挑戰(zhàn)?；旌夏Ｐ驮谏飳W和生物反應(yīng)過程領(lǐng)域越來越受到關(guān)注。迄今為止，這些方法在很大程度上結(jié)合了基本生物機制的知識、化學工程知識、計算流體動力學和其他知識領(lǐng)域，以及使用一些經(jīng)驗測量或觀察的數(shù)據(jù)，以提高對生物反應(yīng)過程的理解。模型中更多的固定元素限制了經(jīng)驗優(yōu)化，以降低過度擬合/局部最小值的風險，并引導整體模型達到可解釋且產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的近似值。使用第一性原理或構(gòu)建砌塊信息來預(yù)測復(fù)雜的結(jié)果有時被稱為全新的方法，例如全新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模，這是我們用來描述Maverick算法原理的術(shù)語。

MAVERICK的全新模型源自1970年代開始研究的關(guān)于多變量校準 ( MVC)  的概率框架，例如Morgan等人的早期研究。它與圖2中常見的經(jīng)驗多變量校準模型形成對比。

在存在一些參考誤差(e)的情況下，經(jīng)驗MVC方法根據(jù)觀測到的光譜數(shù)據(jù) X (X~)和配對參考數(shù)據(jù)(y)  的近似值來估計預(yù)測變量b；b本身的計算是基本的。上述挑戰(zhàn)1-7主要表現(xiàn)在每個領(lǐng)域中‘X’的近似值上，應(yīng)該做什么實驗、在什么硬件上、設(shè)置哪些參數(shù)、在計算b之前應(yīng)該如何修正/處理原始數(shù)據(jù)，以及最終的模型在真正預(yù)期的條件下如何執(zhí)行。

X的近似值對于控制經(jīng)驗方法過度擬合的風險至關(guān)重要，并且在實踐中有許多、許多、許多不同的X  (X~)的可能“近似值"。  PLS（偏最小二乘法）是許多模型方法之一，在許多商用軟件中廣泛使用。在創(chuàng)建X（X~）的過程中，也通常會消除波長范圍或應(yīng)用其他線性或非線性變換。過多可用于建模的‘近似’步驟選項是過度擬合的重要次級來源，因此有時會需要評估數(shù)百或數(shù)千個選項，浪費了大量的廣義自由度。

相比之下，MAVERICK  的全新模型不使用任何憑經(jīng)驗觀察到的X或y數(shù)據(jù)。相反，它使用圖2中術(shù)語（一些靜態(tài)和一些動態(tài)）在時間t為主動測量下的系統(tǒng)創(chuàng)建“最佳線性預(yù)測器" 。雖然這個模型的核心是概率性的，但它的幾個關(guān)鍵參數(shù)可以直接從基于光學、電子學和多元統(tǒng)計學的第一性原理中推導出來。由于這些效應(yīng)在拉曼系統(tǒng)中是動態(tài)的，所以觀察生物反應(yīng)過程，幾個模型選項也是動態(tài)的（這不足為奇）。

公式中參數(shù)K,Ψ代表可觀察拉曼光譜可能的化學/生物化學貢獻者的“主要參數(shù)"以及相關(guān)的預(yù)測概率密度函數(shù)，從中產(chǎn)生濃度估計值。人們可能想知道，如何才能涵蓋公式中的所有可能性。雖然生物反應(yīng)過程中化學/生化物質(zhì)的數(shù)量很可能有數(shù)千種。但拉曼光譜的靈敏度意味著人們實際上只需要考慮0.01  g/L 以 上的主要成分。在哺乳動物培養(yǎng)基中，超過0.01g/L的，我們發(fā)現(xiàn)數(shù)百種常用物質(zhì)以及添加劑（例如表面活性劑、消泡劑）的數(shù)據(jù)。用那么多參數(shù)數(shù)據(jù)對觀測到的拉曼光譜進行去卷積通常是一個不合適的問題；但使用全新模型，是一個充分自我調(diào)節(jié)的解決方案，以產(chǎn)生低方差的濃度估值。

其余條件既取決于設(shè)備，也取決于時間。F是從每個MAVERICK系統(tǒng)的多維出廠特征導出的濾波器函數(shù)，并且實時適應(yīng)于變化的樣本和系統(tǒng)條件。拉曼系統(tǒng)中許多重大誤差來自于光學系統(tǒng)設(shè)計和電子原件。MAVERICK的內(nèi)部系統(tǒng)模型使其能夠?qū)崟r估計∑t 的測量誤差協(xié)方差。相應(yīng)的，系統(tǒng)模型還允許Et自適應(yīng)，例如變化的室內(nèi)照明、溫度和濁度條件。最后，由于在生物反應(yīng)過程中，時間t的系統(tǒng)狀態(tài)與時間t-1的狀態(tài)有關(guān)，因此惰性模型中包括環(huán)境和自回歸分量（Λ）。

質(zhì)量因數(shù)

這個估計模型的幾個重要性質(zhì)先前已經(jīng)討論過，例如預(yù)測均方誤差（MSEP）的解析解。

如上所述，經(jīng)驗?zāi)Ｐ烷_發(fā)中的一個一致性挑戰(zhàn)是模型屬性的不透明性。很少有證明生物過程拉曼應(yīng)用文獻引用所得模型的標準分析優(yōu)值，例如靈敏度、選擇性、LOD，因為多變量模型的文獻定義很復(fù)雜。符合IUPAC定義的靈敏度和選擇性因子可以根據(jù)文獻中所述的過程全新模型直接估計。最后，還可以推斷出其他模型診斷，如平面內(nèi)和平面外一致性，類似于Hoteling或杠桿統(tǒng)計和F參數(shù)：

四、                      模型快速校準：

MAVERICK系統(tǒng)的MAVERICK方法減輕了用戶的巨大建模負擔，但并不能使其擺脫所有形式的“校準"。由于MAVERICK系統(tǒng)被設(shè)計為在測量模塊、光路模塊和探頭之間即插即用，因此在開始生物反應(yīng)過程分析之前，需要進行一個準備步驟來確認定量系統(tǒng)的適用性。這是一個3步過程，由MAVERICK的軟件在HUB屏幕上引導：

1.       將拉曼探頭浸入“LOW"標準液中，按下  ‘GO’并等待大約4分鐘；

2.       將拉曼探頭浸入“HIGH"標準液中，按下  ‘GO’并等待大約4分鐘；

3.       將拉曼探頭插入反應(yīng)器中與反應(yīng)器一起滅菌；

步驟1+2檢查MAVERICK+探頭的一些參數(shù)是否符合全新模型，并對MAVERICK測量模型、光路模塊和探頭的特定組合的全新模型輸出進行快速的標品定標。該參數(shù)還允許對使用帶序列號和芯片的探頭進行自動的審計追蹤。MAVERICK還支持單點“實時"校準，這有助于消除離線分析儀器和MAVERICK之間的數(shù)據(jù)偏差。

五、                      實測案例：

圖3顯示了與一些常見的離線生化分析儀（酶膜法）相比，使用MAVERICK在CHO和HEK293工藝上的分析數(shù)據(jù)。

圖4展示了全新模型提供的一些后臺診斷信息。這些信息是從CHO培養(yǎng)過程中提取的，該過程在一個有大窗戶的實驗室中運行。在上圖中，在估計的RMSE（g/L）中可觀察到的小波動與預(yù)期一致——全新模型正在跟蹤整個晝夜周期的基本背景噪音變化，影響∑t。同樣的影響正在傳播到下圖中對葡萄糖的選擇性，該圖繪制了葡萄糖對前20種其他細胞培養(yǎng)基成分的選擇性：隨著環(huán)境光照的增加，盡管環(huán)境光照發(fā)生了變化，但全新模型仍進行了調(diào)整和自適應(yīng)，以保持選擇性。谷胱甘肽以綠色曲線顯示，雖然它恰好是該生物過程中葡萄糖選擇性“較低"的物種，但正如y軸所示，葡萄糖選擇性仍然很好（>0.99）。

在生物過程的后期階段，細胞/蛋白質(zhì)濃度的增加可以誘導中重度的自發(fā)熒光，這會給經(jīng)驗校準模型帶來很大的困難。全新模型的優(yōu)值反映了這種影響，可以觀察到RMSE的緩慢上升趨勢，但由于全新模型持續(xù)跟蹤和補償背景噪音的增加，從測量誤差模型中的熒光來看，這種影響處理得相當良好。

六、                      Maverick全新模型的限制與機會

全新模型的關(guān)鍵優(yōu)勢—即透明度和避免經(jīng)驗推導模型的陷阱—也可以被認為是其關(guān)鍵局限性。如上所述，如果生物過程的光學活性成分沒有提前確認，則全新模型報告的結(jié)果容易有偏差。數(shù)據(jù)偏差的程度在很大程度上取決于‘未知’物質(zhì)的光學活性：低微克/升水平的痕量金屬元素不會產(chǎn)生影響，因為a）它們是光學無活性的，b）濃度太低，無法在溶液中用拉曼觀察到。通常，只有0.01g/L及以上范圍內(nèi)的共價鍵合有機物質(zhì)才被認為是相關(guān)的。

全新模型也無法支持所謂的“間接傳感器"—即沒有直接的光譜效應(yīng)（如pH），也可以從經(jīng)驗觀測數(shù)據(jù)中推斷出虛擬參數(shù)。如果沒有公式包含的光譜效應(yīng)，就無法使用全新模型。對于那些對間接傳感器建?；驍U展預(yù)測模型感興趣的人，可以選擇將MAVERICK的全光譜導出，該導出可以通過OPCUA實時訪問，也可以在測量會話結(jié)束時作為合并數(shù)據(jù)文件訪問。

還有更多的機會利用Ψ和K的混合建模方法。目前，單個Ψ似乎足以用于哺乳動物的生物過程，但我們正在探索更多樣的自適應(yīng)Ψ培養(yǎng)基系統(tǒng)（例如非CHO或HEK293哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆蟲細胞等）?；蛘撸绻麖臄?shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)明顯不存在的特定配方組分，則對K的動態(tài)進行約束。例如，通過L1型正則化方法。我們注意到，動態(tài)系統(tǒng)模型（如所謂的數(shù)字孿生）也可能直接與全新模型連接，進行連續(xù)的時間數(shù)據(jù)更新。

七、                      后語：

隨著我們在其他分析物和其他細胞/培養(yǎng)基過程中驗證性能，我們有機會繼續(xù)擴展MAVERICK的參數(shù)。此外，隨著流程從早期工藝開發(fā)過渡到中試和生產(chǎn)規(guī)模，全新模型的靈活性可以幫助提高跨規(guī)模/幾何結(jié)構(gòu)的工藝穩(wěn)定性。