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哺乳動物細胞培養(yǎng)對于生物技術行業(yè)的蛋白質生產(chǎn)具有重要意義[1]。制藥行業(yè)中約70%的重組蛋白是使用中國倉鼠卵巢細胞（CHO）生產(chǎn)的。
在灌流培養(yǎng)中，營養(yǎng)物質持續(xù)供應并去除副產(chǎn)物[2]。與批培養(yǎng)和流加補料技術相比，灌流為細胞提供了有利的環(huán)境和較短的產(chǎn)品停留時間。這對于不穩(wěn)定產(chǎn)品的質量尤為重要。灌流模式的另一個優(yōu)點是它允許使用較小的生物反應器并減少在位清洗操作[3]。
灌流需要一種裝置將細胞保留在培養(yǎng)基中。灌流中使用的大多數(shù)哺乳動物細胞保留系統(tǒng)都基于細胞尺寸差異，例如使用濾器。然而，由于濾器不可避免的污染，傳統(tǒng)的過濾膜無法實現(xiàn)真正的穩(wěn)態(tài)灌流培養(yǎng)。此外，頻繁更換過濾器會增加成本和污染風險[4]。
聲學分離器是一種替代的細胞截留系統(tǒng)，利用超聲波駐波場中產(chǎn)生的力將細胞與清液分離。細胞被困在駐波的壓力平面中，并收集為松散的聚集體。這些細胞聚集體通過重力沉降返回生物反應器[4]。
在本研究中，使用了一種針對高密度細胞培養(yǎng)物灌流的Applikon Biosep 10 L聲學細胞分離器的高級版本。生物反應器中，細胞密度在11~144*106 cells/mL之間的CHO細胞評估其性能。
材料和方法
細胞聲學截留裝置 – BioSep
BioSep 系統(tǒng)由聲學腔室和控制器組成。
控制器功能是自動產(chǎn)生聲學腔室內(nèi)的聲場。
來自生物反應器的細胞懸液被泵輸入到安裝在生物反應器頭板上的聲學腔室中。
駐波迫使懸浮細胞進入平面，在那里它們形成松散的聚集體（圖 1）。
清液向上通過聲場而收獲，而濃縮的細胞則返回到生物反應器。
隨著細胞濃度和灌流速率的增加，聲學腔室的功率輸入被調整到更高水平，以保持高分離效率[5]。
運行時間對應于細胞與清液分離的時間段。在運行時間結束時，聲場暫時關閉，收獲暫停，同時腔室中的細胞返回生物反應器。
在這項研究中，功率水平和運行時間發(fā)生了變化，以獲得最佳設置，使高密度CHO 細胞培養(yǎng)超過 125* 106 cells/mL。
實驗裝置
為了評估在一系列高細胞濃度下的分離性能，將CHO 細胞在搖瓶中培養(yǎng)，濃縮、然后懸浮在使用my-Control 操作系統(tǒng)的Applikon 250 mL MiniBio 生物反應器中。
BioSep 10 L的功率水平為2~7W。
實驗設置如圖2所示。
2丨
A） 實驗裝置包括：進料罐、廢液罐、收獲泵、進料泵、聲學室、MiniBio 250 mL、my-Control
B）典型的實驗裝置[5]
3 | 分析方法
•BioSep 的分離效率根據(jù)公式 1 計算:
SE (%) = 1 - HX / BX *100 [1]
其中HX對應于收獲管路的活細胞濃度，BX對應于生物反應器中的活細胞濃度[4]。
為確保穩(wěn)定和可重復的聲學條件，在從收獲管路和生物反應器取樣之前，超聲波功率輸入、收獲速率和運行/反沖洗定時器設置至少恒定 30 分鐘。
根據(jù)所選運行周期的持續(xù)時間，在時間點采集收獲樣本，以獲得一致且可比較的數(shù)據(jù)(表1）。
結果和討論
1| 循環(huán)流速
在高細胞密度的灌流培養(yǎng)過程中，需要高循環(huán)速率，這會導致聲學室內(nèi)的湍流增加。
這種湍流誘導會影響聲學誘導的細胞聚集[6]。
在目前的研究中觀察到新的BioSep版本允許聲學誘導的細胞聚集體不受干擾地沉降，最大流入速率高達7 mL/min（~10 L/天），允許保留超過100*106cells/mL的生物反應器濃度。
2| 分離性能
從收獲管路和生物反應器中采集的70對樣品中測定分離效率。
CHO細胞總濃度范圍為11~144*106 cells/mL。
研究了1~15L/天的不同凈收獲率、2~7 W的功率水平和2至10分鐘的運行時間（未顯示值），結果總結在圖3中。
從圖3中可以看出，當CHO細胞總濃度為100*106cells/mL時，可以實現(xiàn)高達3L/天的凈收獲率，同時保持98%的典型活細胞分離效率。超過4L/天的凈收獲率會影響最高密度下的效率，但分離仍保留了90%以上的細胞。
在總濃度為125*106 cells/mL時，以2L/天的凈收獲率運行，細胞分離效率達到98%。
在細胞濃度增加或收獲率高的情況下，使用高功率水平和更短的運行周期是必要的[5]。
優(yōu)化功率（w）和運行時間（min）的配對，以實現(xiàn)高密度細胞。這些值的組合使得最高的分離效率是：2 w - 10 min;3 W - 5 min;5 W - 3 min;7 W - 2 min。
這些結果是意料之中的，因為更高的功率水平允許在高濃度或高流量條件下增加細胞的保留，而更短的運行時間避免了細胞聚集體在聲室中過度積聚，然后才有機會沉降回到生物反應器。
Figure 3 分離效率以黑色方塊表示，作為記錄的流入管線的凈收獲率和CHO細胞總濃度的函數(shù)。功率水平矩陣表示在該特定凈收獲率下應用的最大HF功率。黃色虛線表示循環(huán)速率20L/天和10L/天之間的邊界。
實驗結論
目前的研究證明了Biosep作為CHO細胞濃度高達125*106cells/mL的細胞保留系統(tǒng)，增強了細胞的沉降效率。在該細胞濃度下，以2 L/天的凈收獲率下運行，分離效率高達98%。
參考文獻
[1]S. M. Woodside, B. D. Bowen, and J. M. Piret, “Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors," Cytotechnology, vol. 28, pp. 163–175, 1998.
[2]T. Kwon, N. Madziva, J. D. Oliveira, S. K. Chandramohan, L. Yin, H. Prentice, J. Han, ‘Long-term steady state perfusion culture of mammalian cells using a robust microfluidic cell retention device". 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, 2015.
[3]M. F. Clincke, C. lleryd, Y. Zhang, E. Lindskog, K. Walsh, and V. Chotteau, “Very high density of CHO cells in perfusion by ATF or TFF in WAVE bioreactor. Part I: Effect of the cell density on the process," Biotechnol. Prog., 2013.
[4]V. M. Gorenflo, J. B. Ritter, D. S. Aeschliman, H. Drouin, B. D. Bowen, and J. M. Piret, “Characterization and optimization of acoustic filter performance by experimental design methodology," Biotechnol. Bioeng., 2005.
[5]Biosep manual 10 and 50 L per day, Applikon Biotechnology.
[6]I. Z. Shirgaonkar, S. Lanthier & A. Kamen, Acoustic cell filter: A proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances, 22(6), 433–444, 2004.
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