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【德國伯托微孔板分析儀：LB942和LB943提供HTRF檢測等多種吸收光、發(fā)光、熒光類型檢測】

技術(shù)背景

      HTRF^®是均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)的簡稱，HTRF^®技術(shù)是對TR-FRET技術(shù)的進(jìn)一步改良，提供了更高的靈敏度和穩(wěn)定性。如今，HTRF^®在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域成為了受歡迎的方法之一。

技術(shù)原理

      HTRF^®技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer） 和時(shí)間分辨熒光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）兩種技術(shù)。該技術(shù)是利用了具有穴狀結(jié)構(gòu)的Eu元素的螯和標(biāo)記物和XL665作為一個(gè)供體（Donor），是基于Eu穴狀化合物的供體與受體（第二熒光標(biāo)記物）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中，受體發(fā)射熒光的壽命等同與供體的發(fā)射熒光的壽命。因?yàn)镋u的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會(huì)誘導(dǎo)XL665受體長時(shí)間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時(shí)間，這樣通過時(shí)間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號。

      當(dāng)由于生物分子相互作用導(dǎo)致兩個(gè)熒光基團(tuán)接近時(shí)，在激發(fā)時(shí)被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長為620nm；另一部分能量轉(zhuǎn)移到受體（acceptor）上，發(fā)射波長為 665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體（donor）引起的FRET產(chǎn)生。所以，當(dāng)生物分子相互作用時(shí)，有兩個(gè)激發(fā)光620nm和 665nm；當(dāng)不存在相互作用時(shí)，只有620nm一個(gè)激發(fā)光。

HTRF各字母所表示的含義

      均相（Homogeneous）是指所有參與反應(yīng)的試劑或化合物無需經(jīng)過吸除處理，反應(yīng)體系內(nèi)的各成分互不影響。時(shí)間分辨熒光（TRF）即TR-FRET，時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移。時(shí)間分辨（Time Resolved）指依靠時(shí)間來去除那些壽命較短的熒光，從而分辨目標(biāo)熒光。F是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的意思，指在供體和受體相互靠得很近時(shí)，光子能從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體），并使后者發(fā)出熒光。

技術(shù)特點(diǎn)

      雖然 HTRF^®也是基于TR-FRET的化學(xué)技術(shù)，但它的許多特點(diǎn)把它與其它TR-FRET產(chǎn)品區(qū)分開來。這些特點(diǎn)包括使用了鑭系元素（銪和鋱），從而具有非常長的半衰期，很大的 Stroke's shift（如右圖所示，Eu3+Stroke's shift > 300 nm）；同時(shí)，鑭系元素與絡(luò)合的穴相結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物(Cryptate)與其它所有TR-FRET產(chǎn)品使用的螯合物結(jié)構(gòu)（Chelate）相比，顯著增加了穩(wěn)定性(可耐受低pH值、金屬離子、DMSO、EDTA等）；專門的比值測量能矯正淬滅和樣品帶來的干擾。

      穴狀化合物的形成是將一個(gè)陽離子納入到一個(gè)立體籠中。籠能收集光然后將能量轉(zhuǎn)移到核心的鑭系元素。大環(huán)的性質(zhì)有利于跟鑭系元素緊密相連，這種不可破的連接會(huì)形成異常穩(wěn)固的復(fù)合體。穴結(jié)構(gòu)能耐受一些特殊的實(shí)驗(yàn)條件如大量存在的陽離子（Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（EDTA）、溶劑或者溫度。從HTRF^® 能應(yīng)用到臨床診斷就能看出它也適用于濃度高的血清（50%）。在讀板前或者孵育時(shí)加入氟離子能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對大量化合物的抗干擾性。穴沒有光漂白性，多次讀數(shù)后信號沒有損失，因此能按照需要的次數(shù)去讀，所以可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測。而螯合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性還未達(dá)到這個(gè)水平。

總體而言，HTRF技術(shù)特點(diǎn)有：

a) 熒光持續(xù)時(shí)間更久

b) 時(shí)間選擇（時(shí)間延遲讀取測量）

c) 低背景

d) 校正干擾因素

e) 均質(zhì)式檢測

f) 能抵御金屬離子對信號的影響