實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）自問(wèn)世以來(lái)，就受到了廣大生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)工作者和醫(yī)院檢驗(yàn)工作者的極大關(guān)注，使得該技術(shù)得到了很快的普及。雖然qPCR技術(shù)目前應(yīng)用方向十分廣泛，但是仍碰到很多用戶在實(shí)驗(yàn)中存在著由于不當(dāng)操作而數(shù)據(jù)精度不高、重復(fù)性差、可信度差等問(wèn)題。在這里，我們根據(jù)實(shí)際工作中的經(jīng)驗(yàn)以及參考萬(wàn)謙等人^[1]的研究，給大家詳細(xì)說(shuō)明一些有助于提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的操作技巧，希望能給大家?guī)?lái)一定的幫助。
 

1、引物的操作技巧：

使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，在操作界面上設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)，擴(kuò)增子參數(shù)一般設(shè)定范圍為80 ～ 200bp，擴(kuò)增子長(zhǎng)度越短，擴(kuò)增效率越高，可選擇設(shè)定在110bp，110bp在后期的擴(kuò)增中僅用10s，其余的參數(shù)均默認(rèn)，軟件即給出引物列表，一般選用評(píng)分高或者靠前的，因?yàn)樵u(píng)分越高或越靠前的引物對(duì)形成引物二聚體的可能越小。
 

引物一般由試劑公司合成，為干粉狀態(tài)，在溶解前，最好用高速離心機(jī)低溫快速離心30s，使得引物干粉匯聚到管底，避免損失引物。引物收到后，需要先摸索引物的退火溫度和終濃度，以達(dá)到較理想的qPCR擴(kuò)增效果，其次測(cè)定引物的擴(kuò)增效率，通常在非正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，假定引物的擴(kuò)增效率為*，擴(kuò)增產(chǎn)物在指數(shù)期呈現(xiàn)2n的增長(zhǎng)。在正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，考慮到引物的擴(kuò)增效率實(shí)際不是100%，所以需要測(cè)定引物的擴(kuò)增效率以修正結(jié)果。一個(gè)測(cè)定引物擴(kuò)增效率的簡(jiǎn)單方法如下: 以cDNA樣品或標(biāo)準(zhǔn)品為模板，依次稀釋 10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶ 倍，采用前期摸索好的qPCR擴(kuò)增條件，得到6個(gè)Cq值，然后以log（模板濃度）為X軸變量，以Cq值為Y軸變量作回歸直線圖，得到直線的斜率，擴(kuò)增效率 = 10( ^{－1 /斜率}) － 1，整個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算可以在Excel中完成，也可在qPCR軟件中直接得出。
 

2、反應(yīng)體系配制技巧：

正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣本至少3個(gè)重復(fù)，為了消除各重復(fù)之間的系統(tǒng)誤差，可配置3.2個(gè)反應(yīng)體系，將所需的所有試劑和模板加在同一個(gè)PCR管中，充分渦旋混勻后，再分裝到3個(gè)重復(fù)孔中，這樣可有效減小系統(tǒng)誤差。另外，一些實(shí)驗(yàn)者為了節(jié)省試劑，采用10μL反應(yīng)體系，我們認(rèn)為這是不可取的，因?yàn)轶w積太小，加樣誤差會(huì)大，這樣做得不償失，建議使用20μL以上的反應(yīng)體積。如上操作，可以在較大程度上消除由于加樣不準(zhǔn)造成的系統(tǒng)誤差。
 

如表1所列，“優(yōu)化前”是5管中分別依次加入模板和各反應(yīng)試劑，最后得到的Cq值標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.66；“優(yōu)化后”是使用模板和各反應(yīng)試劑的混合液，然后分裝至5管中，最后得到的Cq值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 32；由上述可見(jiàn)，數(shù)據(jù)精度得到極大的改善。