增加PCR的特異性
1. primers design
   這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a  足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b  GC% 40%~~~~60%
c  5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d  避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC
   e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
   f. 避免3'端的錯配
   g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)
   h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們
   i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
   j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
   設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
   根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度*行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
   定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。 引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
   Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應的調(diào)整Mg離子的濃度對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
   NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴謹性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當然也就無從談起PCR了.
c. polymerase
   不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真沒的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
    d. template
    50ul PCR SYSTEM  
human gDNA 0.1ug-1ug
    E.Coli 10ng-100ng
    LamadaDNA 0.5ng-5ng
    Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
   常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation
b. annealing
   重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
   原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min